본 연구에서는 건조된 까마중(Solanum nigrum L.) 전초의 50% 에탄올 추출물, 에틸아세테이트 분획, 아글리콘 분획을 이용하여 항산화 실험을 진행하였다. 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)을 이용한 자유라디칼 소거 활성($FSC_{50}$)은 50% 에탄올 추출물, 에틸아세테이트 분획, 아글리콘 분획에서 각각 $215.46{\mu}g/mL$, $42.43{\mu}g/mL$, $52.28{\mu}g/mL$이였다. Luminol-의존성 화학발광법을 이용한 $Fe^{3+}-EDTA/H_2O_2$ 계에서의 총항산화능($OSC_{50}$) 평가에서, 까마중 50% 에탄올 추출물은 $25.25{\mu}g/mL$, 에틸아세테이트 분획은 $7.05{\mu}g/mL$, 아글리콘 분획은 $6.25{\mu}g/mL$를 나타냈다. $^1O_2$로 유도된 적혈구 세포손상에 대한 보호효과 측정에서는 까마중 50% 에탄올 추출물 및 아글리콘 분획은 $5{\sim}25{\mu}g/mL$ 농도에서는 세포보호효과를 나타냈으나 높은 농도에서는 세포보호 활성을 나타내지 않았다. 이러한 결과를 통해 까마중 추출물 및 분획물들은 항산화 활성을 가지고 있지만, 세포 수준에서는 비교적 높은 농도에서 활성산소로 유도된 세포 손상을 촉진할 수도 있음을 시사한다. 따라서 화장품 등에 까마중 추출물을 응용할 때는 사용상 주의가 필요한 것으로 판단된다.
본 연구에서는 건조된 까마중(Solanum nigrum L.) 전초의 50% 에탄올 추출물, 에틸아세테이트 분획, 아글리콘 분획을 이용하여 항산화 실험을 진행하였다. 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)을 이용한 자유라디칼 소거 활성($FSC_{50}$)은 50% 에탄올 추출물, 에틸아세테이트 분획, 아글리콘 분획에서 각각 $215.46{\mu}g/mL$, $42.43{\mu}g/mL$, $52.28{\mu}g/mL$이였다. Luminol-의존성 화학발광법을 이용한 $Fe^{3+}-EDTA/H_2O_2$ 계에서의 총항산화능($OSC_{50}$) 평가에서, 까마중 50% 에탄올 추출물은 $25.25{\mu}g/mL$, 에틸아세테이트 분획은 $7.05{\mu}g/mL$, 아글리콘 분획은 $6.25{\mu}g/mL$를 나타냈다. $^1O_2$로 유도된 적혈구 세포손상에 대한 보호효과 측정에서는 까마중 50% 에탄올 추출물 및 아글리콘 분획은 $5{\sim}25{\mu}g/mL$ 농도에서는 세포보호효과를 나타냈으나 높은 농도에서는 세포보호 활성을 나타내지 않았다. 이러한 결과를 통해 까마중 추출물 및 분획물들은 항산화 활성을 가지고 있지만, 세포 수준에서는 비교적 높은 농도에서 활성산소로 유도된 세포 손상을 촉진할 수도 있음을 시사한다. 따라서 화장품 등에 까마중 추출물을 응용할 때는 사용상 주의가 필요한 것으로 판단된다.
In this study, the antioxidative effects of 50% ethanol extract, ethylacetate fraction and aglycone fraction obtained from dried whole plant of Solanum nigrum L. were investigated. The free radical scavenging activities ($FSC_{50}$) were $215.46{\mu}g/mL$, $42.43{\mu}g/mL$...
In this study, the antioxidative effects of 50% ethanol extract, ethylacetate fraction and aglycone fraction obtained from dried whole plant of Solanum nigrum L. were investigated. The free radical scavenging activities ($FSC_{50}$) were $215.46{\mu}g/mL$, $42.43{\mu}g/mL$ and $52.28{\mu}g/mL$, respectively. Reactive oxygen species (ROS) scavenging activities ($OSC_{50}$) in $Fe^{3+}-EDTA/H_2O_2$ system were $25.25{\mu}g/mL$, $7.05{\mu}g/mL$ and $6.25{\mu}g/mL$, respectively. 50% ethanol extract and aglycone fraction showed the cellular protective effect against $^1O_2$ induced cellular damage of rabbit erythrocytes at $5{\sim}25{\mu}g/mL$, but not at high concentrations. These results indicated that S. nigrum extract/fractions could be used as an antioxidative agent. However, it could induce cellular damage at high concentrations. In conclusion, a special caution is required to use S. nigrum extracts as a cosmetic ingredient.
In this study, the antioxidative effects of 50% ethanol extract, ethylacetate fraction and aglycone fraction obtained from dried whole plant of Solanum nigrum L. were investigated. The free radical scavenging activities ($FSC_{50}$) were $215.46{\mu}g/mL$, $42.43{\mu}g/mL$ and $52.28{\mu}g/mL$, respectively. Reactive oxygen species (ROS) scavenging activities ($OSC_{50}$) in $Fe^{3+}-EDTA/H_2O_2$ system were $25.25{\mu}g/mL$, $7.05{\mu}g/mL$ and $6.25{\mu}g/mL$, respectively. 50% ethanol extract and aglycone fraction showed the cellular protective effect against $^1O_2$ induced cellular damage of rabbit erythrocytes at $5{\sim}25{\mu}g/mL$, but not at high concentrations. These results indicated that S. nigrum extract/fractions could be used as an antioxidative agent. However, it could induce cellular damage at high concentrations. In conclusion, a special caution is required to use S. nigrum extracts as a cosmetic ingredient.
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문제 정의
이와 같이 전자를 제공함으로써 라디칼을 소거하는 능력인 환원력을 통해서 시료의 자유라디칼 소거활성(free radical scavenging concentration, FSC50)을 측정할 수 있다. 따라서 본 실험에서는 비교적 안정한 라디칼로 존재하는 DPPH를 이용하여 까마중 추출물 및 분획의 라디칼 소거활성을 측정하였다.
그러나 열매를 제외한 까마중 전초 추출물의 각종 ROS(H2O2, O2⋅-, · OH 등)가 생성되는 계에서 이들 ROS에 대한 총항산화능 평가나 피부 광노화 과정에서 가장 중요한 활성산소인 1O2으로 유도된 세포 손상에 대한 보호 효과 등 세포 수준에서 항산화나 항노화 활성에 대한 연구는 거의 없는 실정이다. 따라서 본 연구에서는 까마중 전초 추출물 및 분획물들에 대하여 free radical 소거활성, Fe3+-EDTA/H2O2 계에서 생성된 활성산소종에 대한 총항산화능, 1O2으로 유도된 적혈구 세포 손상에 대한 세포보호효과를 측정함으로써 까마중 전초 추출물이 항산화 또는 항노화 화장품 소재로서 응용 가능한지를 조사하고자 하였다.
이들 항산화제는 열과 빛에 매우 불안정하여 화장품에는 ascorbic acid-2-glucoside나 tocopheryl acetate 등의 유도체 형태로 주로 사용되지만 항산화 활성 등은 많이 감소된다. 본 연구실에서는 광노화를 억제할 목적으로 피부 항산화방어망 구축에 적합한 항산화 소재들을 천연 식물 추출물로부터 개발하고자 하는 연구들을 계속해오고 있다. 또한 활성소재의 안정화 및 효능 증대를 위한 피부흡수증진 시스템 개발 연구도 지속해오고 있다[12-14].
특히 광증감반응의 주 생성물인 1O2는 반응성이 매우 강한 활성산소로써 피부 항산화제를 고갈시켜 항산화 방어망을 붕괴시키고, 세포막에서 라디칼 반응을 개시시켜 지질과산화반응을 유발하여 세포 손상을 촉진시킨다. 본 연구에서는 세포막의 지질이중층과 유사한 적혈구세포를 이용한 항산화 평가 시스템을 이용하여 1O2로 유도된 세포손상에 대한 보호효과를 평가하고자 하였다. 까마중 전초의 50% 에탄올 추출물, 에틸아세테이트 및 아글리콘 분획의 1, 10, 25 및 50 μg/mL를 처리하고 광증감제인 rose- bengal로 1O2으로 유도된 적혈구 세포 파괴가 50%가 되는 시간(τ50, min)을 측정하여 세포보호효과를 평가하였다(Table 1).
제안 방법
광용혈에 필요한 광조사는 내부를 검게 칠한 50 cm × 20 cm × 25 cm 크기의 상자 안에 20W 형광등을 장치하고, 형광등으로부터 5 cm 거리에 적혈구 현탁액이 담긴 파이렉스 시험관을 형광등과 평행이 되도록 배열한 후 15 min 동안 광조사 하였다.
광용혈에 필요한 광조사는 내부를 검게 칠한 50 cm × 20 cm × 25 cm 크기의 상자 안에 20W 형광등을 장치하고, 형광등으로부터 5 cm 거리에 적혈구 현탁액이 담긴 파이렉스 시험관을 형광등과 평행이 되도록 배열한 후 15 min 동안 광조사 하였다. 광조사가 끝난 후 암반응(post-incubation) 시간에 따른 적혈구의 파괴정도를 15 min 간격으로 700 nm에서 투광도(transmittance, %)로부터 구하였다. 이 파장에서 적혈구 현탁액의 투광도 증가는 적혈구의 용혈정도에 비례한다.
2 mM DPPH 용액 1 mL에 에탄올 1 mL를 첨가하고 여러 농도의 까마중 전초 추출물 1 mL를 첨가하여 섞은 다음 실온에서 10 min 동안 방치 후 spectrophotometer로 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 활성의 크기는 시료를 넣지 않은 경우를 대조군(control)으로 하고 시료를 넣은 것을 실험군 (experiment)으로 하였다. 자유라디칼 소거활성은 DPPH의 농도가 50% 감소되는데 필요한 시료의 농도 (free radical scavenging activity, FSC50, μg/mL)로서 표기하였으며, 자유 라디칼(DPPH) 소거활성(%)을 계산하는데 사용한 식은 다음과 같다.
그리고 50% 에탄올 추출물을 n-헥산을 이용하여 엽록소 등의 비극성 성분을 제거한 뒤 에틸아세테이트를 이용하여 3회 분획하여 얻은 에틸아세이트 분획을 감압⋅농축하여 파우더를 얻었다.
까마중 전초 추출물 및 분획의 광용혈에 미치는 효과는 post-incubation 시간과 용혈정도로 구성된 그래프로부터 적혈구의 50%가 용혈 되는 시간인 τ50을 구하여 비교하였다.
까마중 전초의 50% 에탄올 추출물, 에틸아세테이트 및 아글리콘 분획의 1, 10, 25 및 50 μg/mL를 처리하고 광증감제인 rose- bengal로 1O2으로 유도된 적혈구 세포 파괴가 50%가 되는 시간(τ50, min)을 측정하여 세포보호효과를 평가하였다(Table 1).
이어서 화학발광기의 cell holder에 튜브를 넣고 5 min 동안 항온시킨 후 150 mM H2O240 μL를 넣고 화학발광을 25min 동안 측정하였다. 대조군(control)은 시료 용액 대신에 증류수를 넣고, 공시험(blank)은 시료 군과 조건이 동일하나 H2O2와 FeCl3ㆍ6H2O 대신 증류수를 첨가하였다. 화학발광기 6-channel LB9505 LT의 각 채널은 실험 전에 보정하여 채널 간의 차이가 거의 없도록 하였다.
시료를 농도별로 각각 50 μL씩 첨가하고 암소에서 30min 동안 pre-incubation 시킨 후, 광증감제 rose-bengal (12 μM) 0.5 mL를 가하고 파라필름(Whatman laboratory sealing film, UK)으로 입구를 막은 후 15 min 동안 광조사 하였다.
Luminol은 활성산소와 반응하여 들뜬상태가 되고 이어서 바닥상태로 되면서 발광한다. 이 계에 항산화제를 첨가하면 감소된 활성산소에 의해 화학발광은 감소하는데 이를 이용하여 총항산화능(ROS scavenging concentration, OSC50)을 평가하였다. 활성산소가 50%감소하는 농도인 OSC50은 까마중 전초 50% 에탄올 추출물이 25.
대상 데이터
(USA) 제품을 사용하였고, pH 미터는 Hanna (Korea)사 제품을 사용하였다. EDTA, luminol, heparin, 광증감제로 사용된 rose bengal, free radical 소거 활성에 사용한 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical은 Sigma chemical Co. (USA)에서 구입하였다. 기타 FeCl3ㆍ6H2O는 Junsei Chemical Co.
UV-visible spectrophotometer는 Varian(Australia)사의 Cary 50, 화학발광기는 Berthold(Germany)사의 6-channel LB9505 LT를, 적혈구 광용혈 실험에 사용한 Spectronic 20D는 Milton Roy Co. (USA) 제품을 사용하였고, pH 미터는 Hanna (Korea)사 제품을 사용하였다. EDTA, luminol, heparin, 광증감제로 사용된 rose bengal, free radical 소거 활성에 사용한 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical은 Sigma chemical Co.
기타 FeCl3ㆍ6H2O는 Junsei Chemical Co. (Japan) 제품을, H2O2는 Dae Jung Chemical &Metals (Korea)사 제품을 사용하였다.
본 실험에 사용한 Fe3+-EDTA/H2O2계에서는 Fenton 반응을 통해 다양한 종류의 활성산소가 생성된다. Luminol은 활성산소와 반응하여 들뜬상태가 되고 이어서 바닥상태로 되면서 발광한다.
비교물질로 사용한 (+)-α-tocopherol (1,000 IU vitamin E/g), L-ascorbic acid는 Sigma Chemical Co. (USA)에서 구입하였다.
실험에 사용된 적혈구 현탁액은 700 nm에서 O.D.값이 0.6이었으며 이때 적혈구 수는 1.5 × 107 cells/mL이었다.
실험에 사용된 토끼 적혈구는 삼육축산농원(경기도 화성군)에서 구입한 생후 6개월 된 건강한 토끼로부터 얻어 채혈 후 heparin이 첨가된 시험관에 넣어 4 ℃의 냉장고에 보관 하고 12 h이내에 실험에 이용하였다. 이를 3,000 rpm으로 5min 동안 원심분리하여 적혈구와 혈장을 분리하고, 분리한 적혈구는 0.
(USA)에서 구입하였다. 실험에 사용한 까마중 전초는 2015년 7월 경동시장에서 구입하여 사용하였다.
(Japan) 제품을, H2O2는 Dae Jung Chemical &Metals (Korea)사 제품을 사용하였다. 완충용액 제조에 사용된 Na2HPO4ㆍ12H2O, NaH2PO4ㆍ2H2O, NaCl, H2SO4 그리고 에탄올(EtOH), 메탄올(MeOH), 에틸아세테이트(EtOAc), n-헥산 등 각종 용매는 시판 특급 시약을 사용하였다. 비교물질로 사용한 (+)-α-tocopherol (1,000 IU vitamin E/g), L-ascorbic acid는 Sigma Chemical Co.
성능/효과
1) 까마중 전초 추출물의 자유라디칼 소거활성(FSC50) 측정 결과, (+)-α-tocopherol (8.98μg/mL) > 에틸아세테이트 분획(42.43μg/mL) > 아글리콘 분획(52.28 μg/mL) > 50% 에탄올 추출물(215.46 μg/mL) 순서로 나타났다.
3) 1O2으로 유도된 적혈구 세포의 파괴에 대한 세포보호효과(τ50) 측정 결과, 50% 에탄올 추출물 및 아글리콘 분획의 경우 5~25 μ g/mL에서 각각 세포보호효과를 나타냈다.
50% 에탄올 추출물에 비하여 에틸아세테이트 분획의 자유 라디칼 소거활성이 약 5배 이상 크게 나타났다. 이와 같이 에틸아세테이트 분획의 자유 라디칼 소거활성이 높은 이유는 에틸아세테이트 분획이 50% 에탄올 추출물로부터 얻은 것이고, 추출 용매인 에틸아세테이트는 극성이 중간 정도로 까마중 전초 추출물 중에서 용매의 극성 도와 비슷한 극성을 나타내는 luteolin, quercetin, rutin, catechin 등의 플라보노이드와 페놀성 화합물들의 함량 비율이 높기 때문인 것으로 판단된다.
50% 에탄올 추출물은 50 μg/mL을 제외하고 농도-의존적으로 세포보호효과를 보였으며, 비교물질인 (+)-α-tocopherol과 유사한 세포보호효과를 보였다.
그러나 이들 방어계는 자외선량이 많으면 압도당할 수 있다. 결과적으로 지질, 단백질 및 DNA와 같은 세포 성분들은 활성산소종에 의한 손상을 받게되어 세포 기능이 변질되고 궁극적으로 피부노화가 일어난다. 이와 같이 자외선으로 유도된 피부노화를 광노화라고 한다[1-3].
이는 까마중 전초 추출물에 존재하는 luteolin, quercetin, rutin,catechin 등의 플라보노이드와 페놀성 화합물들의 함량 비율이 높기 때문인 것으로 보인다[24,25]. 그러나 적혈구 세포를 대상으로 한 활성산소로 유도된 세포 손상에서 일부 아글리콘 분획에서만 낮은 농도에서만 세포보호 효과가 나타났고 높은 농도에서는 용혈 촉진 작용을 나타냈다. 이는 까마중 전초에 존재하는 사포닌이나 알칼로이드 성분들에 의한 결과로 추정되며, 추후 연구를 통해 그 용혈 메커니즘을 알아볼 필요가 있다고 사료된다.
50 μg/mL)보다는 약간 낮은 활성을 나타냈다. 까마중 에틸아세테이트 및 아글리콘 분획은 50% 에탄올 추출물 보다 약 4배 높은 총 항산화 활성을 나타냈다. 이러한 경향은 앞에서 설명한 free radical 소거활성의 경우와 같다.
모든 경우의 실험에서 대조군은 τ50이 32.6 min으로 오차범위 ± 0.1 min 이내로 재현성이 양호하게 나타났다.
아글리콘 분획은 5, 10 μg/mL 농도에서는 (+)-α-tocopherol보다 높은 세포보호효과를 나타낸 반면, 고농도인 25, 50 μg/mL 에서는 용혈 작용을 촉진시켰다. 위 결과를 통해 까마중 추출물 및 분획에는 적혈구의 용혈작용을 촉진하는 성분이 존재함을 알 수 있었으며 특히, 에틸아세테이트 분획에 많이 포함되어 있을 것으로 사료되어진다.
이러한 결과들을 까마중 전초 추출물 및 분획들이 항산화 활성이 있음을 확인하였다. 특히, 자유라디칼 소거활성 및 총항산화능이 50% 에탄올 추출물보다 에틸아세테이트 및 아글리콘 분획에서 약 4배 이상 크게 나타났다.
이러한 결과들을 까마중 전초 추출물 및 분획들이 항산화 활성이 있음을 확인하였다. 특히, 자유라디칼 소거활성 및 총항산화능이 50% 에탄올 추출물보다 에틸아세테이트 및 아글리콘 분획에서 약 4배 이상 크게 나타났다. 이는 까마중 전초 추출물에 존재하는 luteolin, quercetin, rutin,catechin 등의 플라보노이드와 페놀성 화합물들의 함량 비율이 높기 때문인 것으로 보인다[24,25].
후속연구
그러나 적혈구 세포를 대상으로 한 활성산소로 유도된 세포 손상에서 일부 아글리콘 분획에서만 낮은 농도에서만 세포보호 효과가 나타났고 높은 농도에서는 용혈 촉진 작용을 나타냈다. 이는 까마중 전초에 존재하는 사포닌이나 알칼로이드 성분들에 의한 결과로 추정되며, 추후 연구를 통해 그 용혈 메커니즘을 알아볼 필요가 있다고 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
까마중은 무엇인가?
까마중(Solanum nigrum L.)은 가지과에 속하는 한해살이 초본으로 생약명으로는 용규라고도 한다. 열매에 해열작용을 하는 solanine과 solamargine이라는 알칼로이드가 주로 함유되어있고 잎과 줄기에는 사포닌류가 함유되어 있다[15-18].
자외선 노출 과잉으로 항산화 방어계가 무너지면 결과적으로 어떤 문제가 생기는가?
그러나 이들 방어계는 자외선량이 많으면 압도당할 수 있다. 결과적으로 지질, 단백질 및 DNA와 같은 세포 성분들은 활성산소종에 의한 손상을 받게되어 세포 기능이 변질되고 궁극적으로 피부노화가 일어난다. 이와 같이 자외선으로 유도된 피부노화를 광노화라고 한다[1-3].
ROS에는 어떤 것들이 포함되어 있는가?
이와 같이 자외선으로 유도된 피부노화를 광노화라고 한다[1-3]. 피부 노화의 주 원인으로 작용하는 ROS의 종류로는 superoxide anion radical(O2⋅-)과 hydroxyl radical(⋅OH)과 같은 라디칼종과 singlet oxygen(1O2) 및 hydrogen peroxide(H2O2)와 같은 비라디칼종, 그리고 이들 ROS와 생체 구성성분과의 반응으로 생성되는 peroxyl radical(ROO⋅), alkoxyl radical(RO⋅) 등이 포함된다[4]. ROS는 자외선 뿐만 아니라 정상적인 대사과정에서도 생성되며, 질병상태나 스트레스를 받을 때 과잉으로 생성된다.
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