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문제 정의
- 따라서 본 연구는 복분자주에 적용 가능한 알코올 생성능이 우수하고 인체에 유해한 물질인 biogenic amine을 생성하지 않는 토종발효 효모를 선별하고, 통계학적 기법인 반응표면분석법을 이용하여 효모의 균체 대량생산을 위한 최적의 배지조성을 확립하고자 하였다.
- 33%의알코올 생성능을 나타냈다. 이로써 복분자 과실로부터 분리한 효모 S cerevisiae BA29를 이용한 우수한 복분자 와인제조의 가능성을 확인하였다.
제안 방법
- DNA의 추출은 선별한 효모 균주를 YPD broth에 접종하여 30°C에서 2일간 배양한 후 원심분리 하여 ZR Fungal/ Bacterial DNA miniPrep kit(Zymo Research Corp., Irvine, CA, USA)을 이용하여 DNA를 추출하였다. DNA의증폭은 18S rRNA 단편을 증폭하기 위하여 universal pri mer ITS 1(5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3'), ITS 4(5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3')를 사용하여 Lee 등(30)의 방법을 따라 PCR 반응을 실시하였다.
- S. cerevisiae BA29의 균체량 증가를 위 한 배지 조성 의최적화는 발효공정의 최적화를 수행하는 데 가장 효과적인방법 중 하나인 반응표면분석법을 사용하여 수행하였으며, 실험계획은 중심합성계획을 적용하여 최적 배지 농도를 결정하였다. 최적 배양조건 확립을 위한 배지로는 앞선 균체성장에서 6.
- 변형하여 사용하였다. Test tube에 10 mL의 20% glucose를 함유한 YM 액체배지와 듀람관을 넣고 121°C에서 15분간 멸균한 후 분리한 효모의 배양액 2%를 접종하여 교반 없이 25°C에서 2일간 배양하여 가스 생성 여부를 확인하였다. 또한 선별 효모의 배양 상등액을 0.
- 가스 생성능을 갖는 효모의 선별은 van Dijken 등(28)의방법을 변형하여 사용하였다. Test tube에 10 mL의 20% glucose를 함유한 YM 액체배지와 듀람관을 넣고 121°C에서 15분간 멸균한 후 분리한 효모의 배양액 2%를 접종하여 교반 없이 25°C에서 2일간 배양하여 가스 생성 여부를 확인하였다.
- , Tokyo, Japan)를 YPD 액체배지에 첨가한 후 종배양액 2%(v/v)를 접종하여 30oC에서 48시간 동안 배양하여 건조 균체량 측정 방법에따라 균체량을 조사하였다. 당 내성은 3, 30, 40, 50%의 포도당을 함유한 YPD 액체배지에 종배양액 2%(v/v)를 접종한 후 30°C에서 48시간 동안 배양하여 건조 균체량을 조사하였고, 알코올 내성의 조사를 위해 0, 8, 14, 20%(v/v)의무수에탄올(Sigma-Aldrich Co.)을 첨가한 YPD 액체배지에 2%(v/v)의 종배양액을 접종하여 30°C에서 72시간 배양한 후 건조 균체량을 측정하였다.
- 따라서 앞서 선별한 5종의 효모를 대상으로 하여 histamine, tyramine, putrescine, ca- daverine에 대한 biogenic amine 생성 여부를 조사하였다. 대조구로는 앞서 알려진 바와 같이 베리류 과실 자체에 존재하는 biogenic amine의 검줄 가능성을 고려하여 베리류의착즙액을 사용하였고, 복분자 와인을 제조하여 선별 효모에의한 biogenic amine의 생성 여부를 확인하였다. 결과는 Table 2오} 같으며 과실 자체에는 4.
- 5%씩 함유되어 있고 미네랄원소가 풍부하며, 비질소 화합물을 2~8% 함유하고 있고발효 대상 미생물에 무독하여 최근 널리 사용되는 대체 탄소원이다. 따라서 BA29의 균체 성장 및 산업적 활용도를 높이기 위하여 탄소원 glucose를 molasses로 대체하고 앞선 연구를 통하여 각 독립변수의 범위를 결정하고 실험계획을 설정하였다.
- Onal(37)은 histamine, tyramine, pu trescine, cadaverine 등이 포도주에서 검줄됨을 확인하였으며 검줄된 5종의 biogenic amine은 인체 내 유해한 물질로써 심각성을 보고하였다. 따라서 앞서 선별한 5종의 효모를 대상으로 하여 histamine, tyramine, putrescine, ca- daverine에 대한 biogenic amine 생성 여부를 조사하였다. 대조구로는 앞서 알려진 바와 같이 베리류 과실 자체에 존재하는 biogenic amine의 검줄 가능성을 고려하여 베리류의착즙액을 사용하였고, 복분자 와인을 제조하여 선별 효모에의한 biogenic amine의 생성 여부를 확인하였다.
- 하지만 BA29 균주의경우 복분자 와인 발효 시 4종의 biogenic amine이 모두검줄되지 않았다. 따라서 앞선 알코올 발효능과 biogenic amine 생성 여부 결과를 비교하여 복분자 와인 제조에 가장적합한 효모로 BA29를 선정하였다.
- 분리된 균체를 증류수로 3회 세척하고 80°C에서 항량이 될 때까지 건조시킨 후 무게를 측정하였다. 또한 건조 균체량과 비교를 위한 흡광도의측정은 배양액 1 mL를 회수하여 13, 000 rpm에서 20분간원심분리 한 후 증류수에 3회 세척하고 멸균 증류수 1 mL에재 부유하여 660 nm에서 자외선/가시광선 분광광도계 (UV/ VIS spectrophotometer, SPECORD 200, Analytik Jena, Jena, Germany)를 사용하여 흡광도를 측정하고 기록하였다. 알코올 및 glucose 농도는 배양 상등액을 Table 1에따른 조건 하에 HPLC를 이용하여 분석하였고 분석에 필요한 표준 시약 및 기타 시약은 모두 Sigma-Aldrich Co.
- 분석한 염기서열은 National Center for Biotechnology Information(NCBI, Bethesda, MD, USA)의 BLAST를 사용하여 분석한 18S rRNA 단편의 유전자 염기서열 상동성을 근거로 동정하였다. 또한 분리된효모 균주들의 생화학적 동정을 위하여 19가지 탄수화물의이용성으로 효모를 동정하는 API 20C AUX kit(Bio- Merieux, Marcy-l'Etoile, France)을 사용하여 분석하였다.
- 반응표면분석법을 이용하여 수행한 최적화 배지에서의 S cerevisiae BA29의 균체 성장을 검증하기 위하여 통계학적 실험계획법으로 예측된 최적생산배지에 BA29를 접종하여 균체의 생산량을 확인하였다. 대조구로는 최적화를 실시하기 이전의 기본 효모 생장배지인 YPD 액체 배지를 사용하였다.
- 반응표면분석법을 통하여 설정한 조건을 이용하여 S cerevisiae BA29의 주모를 준비한 후 최종적으로 와인 제조를 통하여 S cerevisiae BA29의 알코올 생성 능력을 확인하였다. 5일간 배양 후 7일간 숙성기간을 거친 복분자 와인의 시료 분석 결과 20.
- 반응표면분석 법 은 발효공정 과 생산공정 의최적화를 수행하는 데 가장 영향력이 있는 방법으로 실험계획법은 중심합성계획법(CCD, central composite design) 을 적용하였다. 배지 조성에 대한 실험은 균체량 생산에 중요한 독립변수로 고려되는 인자, 즉 예비실험을 통하여 선별한 molasses(g/L, X1), peptone(g/L, X2), yeast extract (g/L, X3)에 대한 중심값과 범위를 설정하여 각각을 -2, -1, 0, 1, 2의 5개 수준으로 부호화하였다. 또한 독립변수의 영향을 받는 종속변수(Y), 즉 균체량을 측정하여 그 값을 회귀분석에 사용하였다.
- 복분자발효액에 앞서 배양한 효모 2%(v/v)를 접종하고 30°C에서 150 rpm으로 2일간 진탕 배양하여 주모로 사용하였다. 베리류 와인의 제조는 복분자 발효액에 백설탕을 가당하여 22°BriX가 되도록 한 후 멸균하고 급냉하여 선별 효모의주모를 2%(v/v) 접종한 다음 25~30°C에서 5일간 발효하였고, 7일간 숙성 기간을 거쳐 제조하였다.
- 복분자 및 복분자 엑기스로부터 효모를 분리하기 위하여각 시료 원액을 멸균증류수에 십진법으로 희석한 후 200 UL를 취하여 세균의 증식을 억제하기 위한 항생제인 0.25% penicillin-streptomycin(Gibco, Grand Island, NY, USA) 을 첨가한 YM Broth(Difco, Detroit, MI, USA) 고체배지에도말하여 30°C에서 24시간 배양하면서 효모를 분리하였다. 분리 효모는 백금이를 이용하여 YM 평판배지에 획선 도말한 후 30°C에서 2일간 배양하였다.
- 복분자 와인을 제조하기 위해 앞서 최적화한 액체배지에선별한 효모를 접종하여 30°C shaking incubator에서 150 rpm, 1일간 배양한 후 와인 제조를 위한 스타터를 제조하였다. 복분자 발효액은 복분자 과실을 분쇄하여 여과지 (Whatman filter paper No.
- 복분자 와인의 제조를 위하여 복분자 과실 및 엑기스로부터야생효모 Saccharomyces cerevisiae BA29를 분리 및 동정하였으며, 생화학적 특성 및 biogenic amine 생성 여부, 배양학적 특성 및 알코올 발효능과 알코올, 당, 아황산 저항성 을 조사하였다. 또한 S cerevisiae BA29의 산업 적 공정적용을 위한 균체량 증가를 위하여 통계학적 방법인 반응표면분석법을 사용하여 배양 배지 조성의 최적화를 수행하였다.
- 분리 효모의 동정을 위하여 추출한 genomic DNA의 PCR 증폭을 실시하였고 18S rRNA ITS 영역의 염기서열을 분석하였다. 분석된 염기서열은 NCBI의 BLAST 검색을 통하여기존 효모의 염기서열과 상동성을 비교하였으며 그 결과 분리 효모는 S.
- 먼저건조 균체량의 측정을 위하여 10 mL의 배양액은 13, 000 rpm에서 20분간 원심분리 하였다. 분리된 균체를 증류수로 3회 세척하고 80°C에서 항량이 될 때까지 건조시킨 후 무게를 측정하였다. 또한 건조 균체량과 비교를 위한 흡광도의측정은 배양액 1 mL를 회수하여 13, 000 rpm에서 20분간원심분리 한 후 증류수에 3회 세척하고 멸균 증류수 1 mL에재 부유하여 660 nm에서 자외선/가시광선 분광광도계 (UV/ VIS spectrophotometer, SPECORD 200, Analytik Jena, Jena, Germany)를 사용하여 흡광도를 측정하고 기록하였다.
- 증폭된 PCR 산물의 염기서열 분석은 코스모진텍(Seoul, Korea)에의뢰하여 분석하였다. 분석한 염기서열은 National Center for Biotechnology Information(NCBI, Bethesda, MD, USA)의 BLAST를 사용하여 분석한 18S rRNA 단편의 유전자 염기서열 상동성을 근거로 동정하였다. 또한 분리된효모 균주들의 생화학적 동정을 위하여 19가지 탄수화물의이용성으로 효모를 동정하는 API 20C AUX kit(Bio- Merieux, Marcy-l'Etoile, France)을 사용하여 분석하였다.
- 선별 효모 S. cerevisiae BA29를 3%의 glucose를 함유한 YPD 액체배지에 배양하였을 때 시간에 따른 glucose 농도, ethanol 생성량, 흡광도 및 건조 균체량(dried cell weight)의 변화를 조사하였다(Fig. 1A). 균체의 성장은 lag phase가 4~6시간이었으며 stationary phase는 10~12시간이었다.
- 선별 효모의 아황산에 대한 내성 분석을 위하여 아황산에의한 효모의 생육 저해 정도를 조사하였다. 아황산의 함량이 100, 200, 300 ppm이 되게 potassium metabisulfite (K2S2O5, Junsei Chemical Co.
- 따라서 효모 균주의분리를 위하여 베리류 과실 및 엑기스로부터 약 300여 종의효모 분리주를 선별하였고, 선별 분리주는 다음 연구의 진행을 위해 -20°C에 보관하여 사용하였다. 선별한 300여 종의분리주를 대상으로 알코올 발효능이 우수한 효모의 1차 선별을 위하여 durham tube test를 통하여 가스 생성능을 조사하였고, 그 결과 110종의 가스 생성 효모를 선별하였다. 하지만 van Dijken 등(28)의 보고에 따르면 대부분의 효모들은 가스를 생성하지 않으면서도 높은 알코올을 생성하는역할을 수행하기 때문에 추가로 HPLC 분석을 통하여 알코올 생성 여부를 확인한 결과 최종적으로 10종의 효모가 추가된 120종의 효모를 선별하였고 이 중에서 5% 이상의 알코올 생성능을 갖는 5종의 효모를 선별하였다.
- 알코올, 당, 아황산저항성은 특히 포도 와인의 제조과정에서 고농도의 포도당과 알코올 및 아황산이 저장 기간 및 알코올 발효 능력을증진하기 위해서 첨가되기 때문에 와인 제조를 위한 효모로는 필수적인 요소 중 하나이다. 선별한 BA29 균주의 복분자와인 제조를 위한 효모로서의 가능성을 확인하기 위하여 균주의 알코올, 당 및 아황산 내성을 수행하였다. BA29 균주의알코올 내성 조사를 위해 무수 에탄올 0, 8, 14, 20%를 일반효모 배양 배지인 YPD 액체배지에 첨가하여 건조 균체량을조사한 결과는 Fig.
- 선별한 효모의 시간에 따른 균체 및 알코올 생성능 분석을위하여 YPD 액체배지에 선별한 효모를 접종하여 30°C shaking incubator에서 150 rpm, 2일간 배양한 후 알코올생성과 균체 성장의 조사를 위한 전 배양을 실시하였다. 알코올 생성능 조사를 위한 배지는 24% glucose가 함유된 YPD 액체배지를 사용하였고 균체 성장의 조사를 위한 배지는 2% glucose가 함유된 YPD 액체배지를 사용하였으며, 각 액체배지에 전배양액 2%를 접종한 후 30°C, 200 rpm에서 36시간 동안 배양하였다.
- 분리 효모는 백금이를 이용하여 YM 평판배지에 획선 도말한 후 30°C에서 2일간 배양하였다. 순수 분리된 효모 균주는 콜로니를 Yeast Peptone Dextrose(YPD: 1.0% yeast extract, 2.0% peptone, 2.0% dextrose) 액체배지에 접종한 후 30°C shaking incubator(VST203P3V, Vision Scientific Co., Ltd., Daejeon, Korea)에서 2일간 배양한다음 12, 000 rpm, 4°C에서 30분간 원심분리 하여 균체와상등액으로 나눈 후 멸균된 20% glycer이을 첨가하여 -80°C에 보관하여 다음 연구에 사용하였다.
- 알코올 생성능 조사를 위한 배지는 24% glucose가 함유된 YPD 액체배지를 사용하였고 균체 성장의 조사를 위한 배지는 2% glucose가 함유된 YPD 액체배지를 사용하였으며, 각 액체배지에 전배양액 2%를 접종한 후 30°C, 200 rpm에서 36시간 동안 배양하였다. 시간에 따른 균체 및 알코올 생성능의조사를 위하여 2시간 단위로 시료를 취하여 건조 균체량, 알코올 생성능, 흡광도, glucose 농도를 측정하였다. 먼저건조 균체량의 측정을 위하여 10 mL의 배양액은 13, 000 rpm에서 20분간 원심분리 하였다.
- 또한 S cerevisiae BA29의 산업 적 공정적용을 위한 균체량 증가를 위하여 통계학적 방법인 반응표면분석법을 사용하여 배양 배지 조성의 최적화를 수행하였다. 실험계획법은 중심합성계획을 사용하여 모델을 설정하였고, 산업적 공정 적용 시 비용 대비 효율성이 높은 mo- lasses를 대체 탄소원으로 사용하여 실험을 수행하였다. 통계프로그램을 이용하여 분석한 결과 최대 균체 성장을 위한배지 조성으로는 molasses 200 g/L, peptone 30 g/L, yeast extract 40 g/L로 예측되었으며, 이때의 최대 균체량은 20.
- 효모의 생육 저해 정도를 조사하였다. 아황산의 함량이 100, 200, 300 ppm이 되게 potassium metabisulfite (K2S2O5, Junsei Chemical Co., Ltd., Tokyo, Japan)를 YPD 액체배지에 첨가한 후 종배양액 2%(v/v)를 접종하여 30oC에서 48시간 동안 배양하여 건조 균체량 측정 방법에따라 균체량을 조사하였다. 당 내성은 3, 30, 40, 50%의 포도당을 함유한 YPD 액체배지에 종배양액 2%(v/v)를 접종한 후 30°C에서 48시간 동안 배양하여 건조 균체량을 조사하였고, 알코올 내성의 조사를 위해 0, 8, 14, 20%(v/v)의무수에탄올(Sigma-Aldrich Co.
- 여기에서 알코올의 생성량은 기본적으로 당 대사 과정 중 탄소원의 함량에의해 알코올 생성량이 좌우되기 때문에 최소한의 2% glu cose 함유 배지에서는 높은 수치를 보이지는 않았다고 판단된다. 알코올 발효능의 경우 Ju 등(38)이 11 mg/mL의 알코올을 생성한다고 보고한 24%의 glucose가 첨가된 YPD 24 액체배지를 사용하여 조사하였다. 25시간 배양을 완료하였을 때 생산된 알코올은 13.
- 알코올 생성능 조사를 위한 배지는 24% glucose가 함유된 YPD 액체배지를 사용하였고 균체 성장의 조사를 위한 배지는 2% glucose가 함유된 YPD 액체배지를 사용하였으며, 각 액체배지에 전배양액 2%를 접종한 후 30°C, 200 rpm에서 36시간 동안 배양하였다. 시간에 따른 균체 및 알코올 생성능의조사를 위하여 2시간 단위로 시료를 취하여 건조 균체량, 알코올 생성능, 흡광도, glucose 농도를 측정하였다.
- DNA의증폭은 18S rRNA 단편을 증폭하기 위하여 universal pri mer ITS 1(5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3'), ITS 4(5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3')를 사용하여 Lee 등(30)의 방법을 따라 PCR 반응을 실시하였다. 증폭된 PCR 산물의 염기서열 분석은 코스모진텍(Seoul, Korea)에의뢰하여 분석하였다. 분석한 염기서열은 National Center for Biotechnology Information(NCBI, Bethesda, MD, USA)의 BLAST를 사용하여 분석한 18S rRNA 단편의 유전자 염기서열 상동성을 근거로 동정하였다.
- 따라서 와인의 제조에도 산화 방지와 선택적 유해 미생물 억제능을 위하여 사용되고 있어 효모는 와인 제조를 위해 아황산 내성을가질 필요성이 있다. 현재 국내 식품 규격상 350 mg/L의첨가 허용 규격에 맞추어 100, 200, 300 ppm의 아황산을첨가하여 BA29 균주의 아황산 내성을 조사하였다(Fig. 2C). 아황산 첨가에 따라 BA29 균주는 큰 영향을 받지 않고 꾸준한 균체량을 나타내고 있어 우수한 아황산 내성을 지닌 효모임을 확인하였다.
- 효모의 균체량 증가를 위하여 molasses(X1), peptone (X2), yeast extract^)를 독립변수로 설정하고 5단계로 부호화하여 건조 균체량을 종속변수로 하고 중심합성계획법으로 최적화를 실시하였다(Table 4). 3가지 독립변수의 조합에 대한 종속변수의 반응값은 Table 4에 나타내었으며반응값에 대한 회귀분석의 모델식 예측은 Design expert program을 이용하였다.
대상 데이터
- 0%) 과 유도물질 dansyl chloride, 내부표준물질 1, 7-diamino- heptane온 Sigma-Aldrich Co.(St. Louis, MO, USA)에서, proline과 0.1 N HCl온 Samchun(Seoul, Korea), acetoni trile온 Mallinckrodt J. T. Baker(Phillipsburg, NJ, USA) 에서 구입하여 사용하였고 각 표준품 및 내부표준물질은 0.1 N HCl에 녹여 약 1, 000 mg/L가 되도록 한 것을 십진법으로 희석하여 표준용액으로 사용하였다. 복분자 와인의 biogenic amine의 검줄은 Jeong 등(29)의 방법을 사용하여다음과 같이 수행하였다.
- cerevisiae BA29 cultivated in YPD 24 medium (as medium for alcohol fermenting ability) at 30oC with 150 rpm. The experiments were carried out in triplicate. o, concentration of glucose; ▲, dried cell weight; △, contents of ethanol; ●, absorbance 660 nm.
- 균체의 생산량을 확인하였다. 대조구로는 최적화를 실시하기 이전의 기본 효모 생장배지인 YPD 액체 배지를 사용하였다. 최적배지에서 배양을 실시한 결과 BA29의 건조 균체량은 20.
- cerevisiae를 스타터로 사용하여 와인의 품질 향상을 도모하고 있으며, 알코올 발효능이우수하고 와인 제조 시 품질 향상에 도움이 되는 효모의 선별에 많은 노력을 기울이고 있다(31). 따라서 효모 균주의분리를 위하여 베리류 과실 및 엑기스로부터 약 300여 종의효모 분리주를 선별하였고, 선별 분리주는 다음 연구의 진행을 위해 -20°C에 보관하여 사용하였다. 선별한 300여 종의분리주를 대상으로 알코올 발효능이 우수한 효모의 1차 선별을 위하여 durham tube test를 통하여 가스 생성능을 조사하였고, 그 결과 110종의 가스 생성 효모를 선별하였다.
- 사용하였다. 와인 발효 시 보당용 정백당으로는 백설탕(Cheijedang, Seoul, Korea)을 사용하였다.
- cerevisiae BA29의 균체량 증가를 위 한 배지 조성 의최적화는 발효공정의 최적화를 수행하는 데 가장 효과적인방법 중 하나인 반응표면분석법을 사용하여 수행하였으며, 실험계획은 중심합성계획을 적용하여 최적 배지 농도를 결정하였다. 최적 배양조건 확립을 위한 배지로는 앞선 균체성장에서 6.39 g/L의 최대 균체량을 나타낸 기본 YPD 액체배지를 사용하였으며, 탄소원의 경우 예비실험 및 앞선 연구논문의 조사를 통해 확인한 glucose 대신 molasses(Mauri- tius Sugar Syndicate, Port Louis, Mauritius)를 사용하였다. Molasses는 균체량 증가를 위한 산업적 응용을 위해사용되는 대체 탄소원으로 미생물의 생장에 필요한 영양분이 풍부하며, pH 5.
- cerevisiae B1 type으로 확인되 었으며 그 결과는 Table 3과 같다. 최종 선별된 BA29 균주는 한국미생물보존센터 (KCCM, Korean Culture Center of Microorganisms, Seoul, Korea)에 S cerevisiae BA29 KCCM 11507P로기탁하였다.
- 효모의 분리 및 복분자 와인 제조를 위한 복분자 과실은 2014년 전라북도 순창으로부터 재배된 생과를 구매하여 blender(Waring, Torrington, CT, USA)를 이용하여 마쇄한 후 사용하였고, 순창군 쌍치면 농가에서 재배하여 제조한복분자 엑기스를 추가로 구매하여 효모 분리에 사용하였다. 와인 발효 시 보당용 정백당으로는 백설탕(Cheijedang, Seoul, Korea)을 사용하였다.
데이터처리
- 또한 독립변수의 영향을 받는 종속변수(Y), 즉 균체량을 측정하여 그 값을 회귀분석에 사용하였다. 3회(중심점 3회) 반복 실험하여 평균값을회귀분석에 사용하였으며 이때 3개의 독립변수와 종속변수에 대한 2차 회귀 모형식은 아래와 같다.
- 을 조사하였다. 또한 S cerevisiae BA29의 산업 적 공정적용을 위한 균체량 증가를 위하여 통계학적 방법인 반응표면분석법을 사용하여 배양 배지 조성의 최적화를 수행하였다. 실험계획법은 중심합성계획을 사용하여 모델을 설정하였고, 산업적 공정 적용 시 비용 대비 효율성이 높은 mo- lasses를 대체 탄소원으로 사용하여 실험을 수행하였다.
- 배지 조성에 대한 실험은 균체량 생산에 중요한 독립변수로 고려되는 인자, 즉 예비실험을 통하여 선별한 molasses(g/L, X1), peptone(g/L, X2), yeast extract (g/L, X3)에 대한 중심값과 범위를 설정하여 각각을 -2, -1, 0, 1, 2의 5개 수준으로 부호화하였다. 또한 독립변수의 영향을 받는 종속변수(Y), 즉 균체량을 측정하여 그 값을 회귀분석에 사용하였다. 3회(중심점 3회) 반복 실험하여 평균값을회귀분석에 사용하였으며 이때 3개의 독립변수와 종속변수에 대한 2차 회귀 모형식은 아래와 같다.
- 3에 나타내었다. 또한 주어진 데이터에 대한 정확한 최적점을 찾기 위하여 모수추정에 의한 회귀식을 바탕으로 능선분석을 수행하였고, 최종적으로 반응표면분석을 통하여 BA29의 균체 성장에 가장 영향을 주는 독립변수의 농도를 찾을 수 있었다. 실험범위 내에서 mo- lasses의 첨가량이 증가할수록 균체량이 증가하였으나 yeast extract는 큰 영향을 주지 않았으며, peptone의 경우 첨가량이 증가할수록 균체량이 감소하는 것을 알 수 있었다.
- 는 회귀계수이다. 회귀 분석에 의한 모델식의 예측은 Design EXpert 9.0(Version 9.0.3.1, Stat-Ease Inc., Minneapolis, MN, USA)을 이용하여 통계적으로 분석하였고, 회귀분석 결과 임계점을 분석하여 최고 균체 생산을 위한 각 배지 성분의 최적 농도를 결정하였다.
- 효모 균체량 증가를 위한 배지성분의 최적 농도를 결정하기 위해 배지 성분 각각의 농도 변화가 균체 생산성에 미치는 영향을 반응표면분석법을 이용하여 통계적으로 최적화를 수행하였다. 반응표면분석 법 은 발효공정 과 생산공정 의최적화를 수행하는 데 가장 영향력이 있는 방법으로 실험계획법은 중심합성계획법(CCD, central composite design) 을 적용하였다.
이론/모형
- 최적화를 실시하였다(Table 4). 3가지 독립변수의 조합에 대한 종속변수의 반응값은 Table 4에 나타내었으며반응값에 대한 회귀분석의 모델식 예측은 Design expert program을 이용하였다. 분산분석 결과 R-square(결정계수)는 0.
- , Irvine, CA, USA)을 이용하여 DNA를 추출하였다. DNA의증폭은 18S rRNA 단편을 증폭하기 위하여 universal pri mer ITS 1(5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3'), ITS 4(5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3')를 사용하여 Lee 등(30)의 방법을 따라 PCR 반응을 실시하였다. 증폭된 PCR 산물의 염기서열 분석은 코스모진텍(Seoul, Korea)에의뢰하여 분석하였다.
- 수행하였다. 반응표면분석 법 은 발효공정 과 생산공정 의최적화를 수행하는 데 가장 영향력이 있는 방법으로 실험계획법은 중심합성계획법(CCD, central composite design) 을 적용하였다. 배지 조성에 대한 실험은 균체량 생산에 중요한 독립변수로 고려되는 인자, 즉 예비실험을 통하여 선별한 molasses(g/L, X1), peptone(g/L, X2), yeast extract (g/L, X3)에 대한 중심값과 범위를 설정하여 각각을 -2, -1, 0, 1, 2의 5개 수준으로 부호화하였다.
- 1 N HCl에 녹여 약 1, 000 mg/L가 되도록 한 것을 십진법으로 희석하여 표준용액으로 사용하였다. 복분자 와인의 biogenic amine의 검줄은 Jeong 등(29)의 방법을 사용하여다음과 같이 수행하였다. 제조한 복분자 와인 5 mL에 0.
성능/효과
- 5일간 배양 후 7일간 숙성기간을 거친 복분자 와인의 시료 분석 결과 20.33%의 알코올 생산 능력을 나타내었다. 일반적으로 에탄올 생성량은 발효성 당의 55% 정도로분석되는데(42), S cerevisiae BA29를 이용하여 제조한복분자 와인의 알코올 함량이 높은 것으로 보아 당 소비를통한 알코올 발효 능력이 우수한 것으로 나타나 산업적으로대량 와인 제조 시 매우 유용한 균주로 사용될 것으로 사료된다.
- 05보다 작으므로 가정된 실험모형이 자료에 적합함을 확인하였다. 또한 변동계수。、coffeicient of var- iation)는 6.84로 상대적으로 낮은 수치를 나타내어 균체량생산에 변수들의 독립적인 영향뿐만 아니라 변수들 간의 상호작용도 매우 높음을 나타내었다(Table 5). 균체량에 대한반응표면 회귀식은 아래와 같이 분석되었다.
- 대조구로는 앞서 알려진 바와 같이 베리류 과실 자체에 존재하는 biogenic amine의 검줄 가능성을 고려하여 베리류의착즙액을 사용하였고, 복분자 와인을 제조하여 선별 효모에의한 biogenic amine의 생성 여부를 확인하였다. 결과는 Table 2오} 같으며 과실 자체에는 4.20 mg/L의 histamine 이 검줄되어 Vasantha Rupasinghe오} Clegg(32)의 결과와동일하게 과실 자체에도 histamine이 존재하고 있음을 확인하였고, 선별 균주를 이용하여 제조한 복분자 와인에서는 tyramine 또는 histamine이 검줄되었으나 대부분 정량이되지 않는 미비한 수치를 나타내었으며, 선별 효모 모두 pu trescine은 생성하지 않았고 cadaverine의 경우 BA31 균주에서만 1.04 mg/L가 검출되었다. 하지만 BA29 균주의경우 복분자 와인 발효 시 4종의 biogenic amine이 모두검줄되지 않았다.
- 6565 g/L오} 차이를 보이지 않았다. 따라서 중심합성법을 이용하여 실시한 실험모델의 예측값이 신뢰할 수 있음을 확인하였고 최적화를 실시하기 전의 YPD 액체 배지에서의 균체량 6.39 g/L와 비교하면 3.27배증가하였으며, 14.5267 g/L의 균체량이 향상되었다(Fig. 4). 탄소원을 molasses로 대체하여 최적화를 수행한 결과대체 탄소원으로 고과당(high fructose syrup)을 사용하여 S cerevisiae 균주의 균체 성장 최적화를 수행한 Kim 등 (27)의 16.
- 95 g/L보다도 높은 균체 성장을 나타내었다. 또한 이 결과는 효모의 균체 성장을 증가시키기 위한 대체 탄소원으로 molasses를 사용할 경우 산업적인 측면에서도 비용대비 균체 성장에 효율적인 방법임을 확인할 수 있다.
- 6565 g/L로 예측되었다. 모델의 검증실험 결과 기본 배양 배지와 비교하였을 때 6.39 g/L에서 20.9167±0.7925 g/L로 약 3.27배 증가하였다. 최종적으로 S cerevisiae BA29를 사용하여 복분자 와인을 제조한 결과 20.
- 3가지 독립변수의 조합에 대한 종속변수의 반응값은 Table 4에 나타내었으며반응값에 대한 회귀분석의 모델식 예측은 Design expert program을 이용하였다. 분산분석 결과 R-square(결정계수)는 0.9721로 1에 가까운 값을 나타내어 5% 이내의 유의수준에서 유의성이 인정되었고, 전체 모델의 유의확률이 0.0001로 0.05보다 작으므로 가정된 실험모형이 자료에 적합함을 확인하였다. 또한 변동계수。、coffeicient of var- iation)는 6.
- 분석된 염기서열은 NCBI의 BLAST 검색을 통하여기존 효모의 염기서열과 상동성을 비교하였으며 그 결과 분리 효모는 S. cerevisiae로 동정되 었고, S. cerevisiae BA29 로 명명하였다. 또한 선별한 BA29의 당 이용성을 확인하기위해 API 20C AUX kit을 이용하여 조사한 결과 BA29는 maltose오} sucrose, galactose, glucose의 이용성이 높은 S.
- 또한 주어진 데이터에 대한 정확한 최적점을 찾기 위하여 모수추정에 의한 회귀식을 바탕으로 능선분석을 수행하였고, 최종적으로 반응표면분석을 통하여 BA29의 균체 성장에 가장 영향을 주는 독립변수의 농도를 찾을 수 있었다. 실험범위 내에서 mo- lasses의 첨가량이 증가할수록 균체량이 증가하였으나 yeast extract는 큰 영향을 주지 않았으며, peptone의 경우 첨가량이 증가할수록 균체량이 감소하는 것을 알 수 있었다. 최대균체량은 20.
- 2C). 아황산 첨가에 따라 BA29 균주는 큰 영향을 받지 않고 꾸준한 균체량을 나타내고 있어 우수한 아황산 내성을 지닌 효모임을 확인하였다.
- 대조구로는 최적화를 실시하기 이전의 기본 효모 생장배지인 YPD 액체 배지를 사용하였다. 최적배지에서 배양을 실시한 결과 BA29의 건조 균체량은 20.9167±0.7925 g/L로 앞서 반응표면분석법을 통해 예측된 건조 균체량 20.6565 g/L오} 차이를 보이지 않았다. 따라서 중심합성법을 이용하여 실시한 실험모델의 예측값이 신뢰할 수 있음을 확인하였고 최적화를 실시하기 전의 YPD 액체 배지에서의 균체량 6.
- 27배 증가하였다. 최종적으로 S cerevisiae BA29를 사용하여 복분자 와인을 제조한 결과 20.33%의알코올 생성능을 나타냈다. 이로써 복분자 과실로부터 분리한 효모 S cerevisiae BA29를 이용한 우수한 복분자 와인제조의 가능성을 확인하였다.
- 4). 탄소원을 molasses로 대체하여 최적화를 수행한 결과대체 탄소원으로 고과당(high fructose syrup)을 사용하여 S cerevisiae 균주의 균체 성장 최적화를 수행한 Kim 등 (27)의 16.95 g/L보다도 높은 균체 성장을 나타내었다. 또한 이 결과는 효모의 균체 성장을 증가시키기 위한 대체 탄소원으로 molasses를 사용할 경우 산업적인 측면에서도 비용대비 균체 성장에 효율적인 방법임을 확인할 수 있다.
- 실험계획법은 중심합성계획을 사용하여 모델을 설정하였고, 산업적 공정 적용 시 비용 대비 효율성이 높은 mo- lasses를 대체 탄소원으로 사용하여 실험을 수행하였다. 통계프로그램을 이용하여 분석한 결과 최대 균체 성장을 위한배지 조성으로는 molasses 200 g/L, peptone 30 g/L, yeast extract 40 g/L로 예측되었으며, 이때의 최대 균체량은 20.6565 g/L로 예측되었다. 모델의 검증실험 결과 기본 배양 배지와 비교하였을 때 6.
후속연구
- 일반적으로 에탄올 생성량은 발효성 당의 55% 정도로분석되는데(42), S cerevisiae BA29를 이용하여 제조한복분자 와인의 알코올 함량이 높은 것으로 보아 당 소비를통한 알코올 발효 능력이 우수한 것으로 나타나 산업적으로대량 와인 제조 시 매우 유용한 균주로 사용될 것으로 사료된다. 추후 산업적 적용 및 실용화를 위해서는 안전성 및와인 제조 단계의 최적화, 기능성 분석, 관능 평가 등 더 많은연구가 필요하지만 우수한 복분자 와인 제조의 가능성을 확인하였다.
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