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문제 정의
- 5h으로 예측하였다. 본 연구는 주로 열수추출물의 형태로 유 통되는 차가버섯 추출물의 품질 개선을 위하여 에탄올 용매를 포함한 최적 추출조건을 설정하였고, 구체적인 추출 수율과 생리활 성물질 함량 및 항산화능이 최대가 되는 추출조건을 제시하였다.
- 본 연구에서는 차가버섯(Inonotus obliquus)의 유효성분과 항산 화능이 최대가 되는 추출물의 제조를 위하여 반응표면분석법을 이용하여 최적 추출조건을 탐색하였다. 추출 수율, 총 폴리페놀 함량 항산화능(ABTS 자유 라디칼 소거능, ORAC), p-1,3-glucan 함량의 총 다섯 가지 반응변수에서 유의적인 이차 회귀식을 얻 었고, 반응표면그래프와 둥고선도를 통하여 최적 추출조건을 예 측하였다.
- , SeoμL, Korea)총 glucan 함량 p-glucan 함량, p-1, 3-glucan 함량이 최대로 나타 를 이용하여 환류 추출하였다. 차가버섯 분말 10 g을 둥근 플라 나는 조건을 탐색하고자 하였다.
제안 방법
- Mushroom p-glucan kit에서 제공한 방법에 따라 이 kit를 사용하여 종 glucan과 a-glucan 함량을 측정하고 a잉ucan 함량을 제외한 나머지를 p-glucan의 함량으로 계산하였다. P-1,3-Glucan의 함량 분석은 P-1,3-glucan의 p-1,3 결합에 aniline blue 염색약이 반 응하여 fluorescence가 발현되는 현상을 이용한 Ko와 Lin(16)의 방법으로 측정하였다.
- ORACe Huang 둥(15)의 방법을 변형하여 측정하였다. AAPH 는 75mM phosphate buffer (pH 7.
- 4)로 희석하여 40nM의 농도가 되도록 하였다. μClear® black clear bottom 96- well microplate (Greiner Bio-one, Frickenhausen, Germany)에 40 nM fluorescein solution 150 μL와 75 mM phosphate buffer (pH 7.4)에 녹인 시료 25 μL를 가하고 37oC에서 30분간 반응시킨 후 25 0의 153mM AAPH 용액을 가한 후 37oC에서 90초 간격으 로 100 cycle 동안 fluorescence microplate reader FLx800 (BioTek Instruments Inc., Winooski, VT, USA)을 이용하여 excitation 485nm와 emission 520nm에서 형광 값을 측정하였다. 종 cycle 동안 측정한 형광 값은 아래의 방법으로 AUC (area under the curve; (a))와 net AUC (b)를 구하였다.
- 예 측 값과 실험 값의 차이는 상대오차(relative error)로 나타내어 모델의 정확도를 검증하였다. 각 반응변수에 대한 반응모델의 정확 도를 검증하여 추출조건에 따른 반응을 설명하는데 적합하다고 판단되면 모든 반응변수를 최적화할 수 있는 하나의 추출조건을 설정하였다.
- 이 반응액에 20% (w/v) NeCQ 용액 300 μL를 가하고 40oC에서 30분 동안 반응시켰다. 그 후 각 시료들의 흡광도 를 Spectramax 190 (MolecμLar Devices, Sunnyvale, CA, USA)을 이용하여 765nm에서 측정하였다.
- , 제조조건에 세가지 독립변수(에탄올 함량, 추출 온도, 추출 시간) Incheon, Korea)를 이용하여 polyethylene pouch (Rollpack, Pyeo- 를 이용하여 반응표면분석법을 통해 추출 수율, 총 폴리페놀 함 ngtaek, Korea)에 포장하여 실온에 보관하며 추출에 사용하였다.량, 항산화능(ABTS free radical scavanging activity, ORAC), 차가버섯 분말을 항온수조(Daihan Scientific Co., SeoμL, Korea)총 glucan 함량 p-glucan 함량, p-1, 3-glucan 함량이 최대로 나타 를 이용하여 환류 추출하였다. 차가버섯 분말 10 g을 둥근 플라 나는 조건을 탐색하고자 하였다.
- 결론적으로 각 반응변수의 이차 회귀식이 유의하고, 예측 값과 실험 값의 오차가 크지 않아 각 반응표면모델이 추출조건에 따른 반응변수를 설명하는데 적합하 다고 판단하였다. 이에 다섯 가지의 반응 변수를 모두 고려하면 에탄올 농도 81.4%, 추출 온도 92.7oC, 추출 시간 14.5 h의 추출 조건이 모든 반응변수에서 최대값을 가지는 최적 추출조건으로 예측하였다.
- 또한 추출조건에 따른 차가버섯 추출물의 생리활성물 질 함량과 항산화능이 최대가 되는 추출 공정의 최적화에 관한연구는 없는 실정이다. 이에 본 연구에서는 차가버섯 추출물의 SeoμL, Korea)로 거른 후 진공 포장기 (M-6TM, Leepack Co., 제조조건에 세가지 독립변수(에탄올 함량, 추출 온도, 추출 시간) Incheon, Korea)를 이용하여 polyethylene pouch (Rollpack, Pyeo- 를 이용하여 반응표면분석법을 통해 추출 수율, 총 폴리페놀 함 ngtaek, Korea)에 포장하여 실온에 보관하며 추출에 사용하였다.량, 항산화능(ABTS free radical scavanging activity, ORAC), 차가버섯 분말을 항온수조(Daihan Scientific Co.
- Potassium phosphate monobasice 동양제 철화학(SeoμL, Korea)에서 구입하였으며, potassium phosphate dibasice Junsei Chemical (Tokyo, Japan)에서 구입하였다. 총 glucan 과 p-glucan 함량은 mushroom p-glucan kit (K-YBGL, Megazyme International, Wicklow, Ireland)를 구입하여 즉정하였다.
- 4 (open source software)를 이용하였다. 최적 추출조건을 찾기 위한 과정으로 정상점(stationary point)의 형태를 통하여 반응표면그래 프와 등고선도가 최대점 (maximum point), 최소점 (minimum point), 안장점 (saddle point) 및 능선(rising ridge)의 형태인지를 판단하였다. 그 후 Minitab software를 이용하여 최적 추출조건을 예측하 였고, 실제 실험을 통하여 예측된 값의 정확도를 검증하였다.
- 추출조건과 순서 는 Table 2와 같이 임의 순서로 진행하였다. 최적화하려는 반응 변수(response variable)는 추출수율, 총 폴리페놀 함량 ABTS 자 유 라디칼 소거능, ORAC, 총 glucan 함량, p-glucan 함량, P-1,3- glucan 함량이며, 다음과 같은 반응변수 각각의 이차 회귀식을 유 도하였다(9).
- 본 연구에서는 차가버섯(Inonotus obliquus)의 유효성분과 항산 화능이 최대가 되는 추출물의 제조를 위하여 반응표면분석법을 이용하여 최적 추출조건을 탐색하였다. 추출 수율, 총 폴리페놀 함량 항산화능(ABTS 자유 라디칼 소거능, ORAC), p-1,3-glucan 함량의 총 다섯 가지 반응변수에서 유의적인 이차 회귀식을 얻 었고, 반응표면그래프와 둥고선도를 통하여 최적 추출조건을 예 측하였다. 각 반응변수에 따른 최적 추출조건은 추출 수율에서 50% (v/v), 88.
- 추출조건에 따른 반응변수의 이차 회귀식이 유의적일 때 추가 적으로 반응표면그래프와 등고선도를 사용하여 이차 회귀식 모델의 형태를 파악하였고 최적 추출조건을 결정하였다. 각 반응변수의 반응표면그래프와 등고선도는 추출 시간은 8h로 고정하고 에탄올 함량(Xi)과 추출 온도(X，)에 따른 상호작용을 나타내었다 (Fig.
- )하였다. 표준물 질로는 curdlan을 이용하여 검량선을 그려 P-1,3-glucan 함량을 구 하였다.
- 표준물질로 사용한 trolox의 농도별 net AUC 값을 이용하여 검 량선을 그리고 각 시료별 TEAC를 산출했다.
대상 데이터
- 5% ethanol, aniline blue는 삼전화 학(SeoμL, Korea)에서 구입하였다. 2,2-Azobis (2-methylpropionamidine) dihydrochloride (AAPH)와 curdlane Wako-Chemical (Osaka, Japan)에서 구입하였다. Potassium phosphate monobasice 동양제 철화학(SeoμL, Korea)에서 구입하였으며, potassium phosphate dibasice Junsei Chemical (Tokyo, Japan)에서 구입하였다.
- 2,2-Azobis (2-methylpropionamidine) dihydrochloride (AAPH)와 curdlane Wako-Chemical (Osaka, Japan)에서 구입하였다. Potassium phosphate monobasice 동양제 철화학(SeoμL, Korea)에서 구입하였으며, potassium phosphate dibasice Junsei Chemical (Tokyo, Japan)에서 구입하였다. 총 glucan 과 p-glucan 함량은 mushroom p-glucan kit (K-YBGL, Megazyme International, Wicklow, Ireland)를 구입하여 즉정하였다.
- Louis, MO, USA)에서 구입하였다. Sodium carbonate, sodium hydroxide, potassium hydroxide, acetic acid (glacial), hydrochloric acid, 99.5% ethanol, aniline blue는 삼전화 학(SeoμL, Korea)에서 구입하였다. 2,2-Azobis (2-methylpropionamidine) dihydrochloride (AAPH)와 curdlane Wako-Chemical (Osaka, Japan)에서 구입하였다.
- 러시아의 튜멘 지역에서 채취한 차가버섯을 (주)DHF (SeoμL, 조(NB-504, Ilshin Co., Dongducheon, Korea)하여 -20oC에서 냉동 Korea) 를 통하여 제공받아 사용하였다. 보관하며 실험에 사용하였다.
- 실험 범위에 따라 부호화된 독립변수와 코드화되지 않은 독립변수는 Table 1과 같다. 본 연구는 3개의 인자와 3개의 수준으로 이루어져 중 심점이 6개(cube: 4, axial: 2)이며 축점(a=1.633)에서의 실험이 추 가된 총 20개의 실험으로 구성하였다(Table 2). 추출조건과 순서 는 Table 2와 같이 임의 순서로 진행하였다.
- 실험 시으약 중 Folin Ciocalteu’s phenol reagent, gallic acid, 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sμLfbnic acid) diammounium salt (ABTS), potassium persμLfate, 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid (Trolox), fluorescein salt, glycine온 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하였다. Sodium carbonate, sodium hydroxide, potassium hydroxide, acetic acid (glacial), hydrochloric acid, 99.
- 차가버섯 분말을 항온수조(Daihan Scientific Co., SeoμL, Korea) 를 이용하여 환류 추출하였다. 차가버섯 분말 10 g을 둥근 플라 스크에 넣고 추출 용매 400 mL를 사용하여 추출하였다.
데이터처리
- 각 반응변수의 최적 추출조건은 Minitab software의 ‘response optimizer’를 이용하여 예측하였다. 각 최적 추출조건은 Table 6과 같으며, 예측된 최적 추출조건에서 실제 추출 및 실험을 수행하여 예측된 값과 실제 실험값의 비교를 통하여 모델의 정확도를 검증하였다. 예측 값과 실험 값의 차이는 상대오차를 통해 표현하였다.
- 최적 추출조건을 찾기 위한 과정으로 정상점(stationary point)의 형태를 통하여 반응표면그래 프와 등고선도가 최대점 (maximum point), 최소점 (minimum point), 안장점 (saddle point) 및 능선(rising ridge)의 형태인지를 판단하였다. 그 후 Minitab software를 이용하여 최적 추출조건을 예측하 였고, 실제 실험을 통하여 예측된 값의 정확도를 검증하였다. 예 측 값과 실험 값의 차이는 상대오차(relative error)로 나타내어 모델의 정확도를 검증하였다.
- 모든 반응 변수는 다중회귀분석 (mμLtiple regression analysis)과 분산분석(ANOVA)을 수행하였고, 이로부터 얻은 이차 회귀식을 통하여 반응모델의 적합성을 검증하였으며, 통계 분석은 Minitab 14 software (Minitab Inc., State College, PA, USA)를 이용하였다. 반응모델의 반응표면그래프와 둥고선도는 SciDAVis software v0.
- 본 연구에서는 반응표면분석법 중 중심합성법을 이용하여 추 출조건에 따른 총 20회의 실험을 계획하였고 각 반응 변수의 실 험값을 다중회귀분석 및 분산분석을 통하여 분석하였다. 실험 조 건에 따른 각 반응변수의 실험값은 Table 3과 같고 유도된 이차 회귀식은 Table 4와 같다.
- 그 후 Minitab software를 이용하여 최적 추출조건을 예측하 였고, 실제 실험을 통하여 예측된 값의 정확도를 검증하였다. 예 측 값과 실험 값의 차이는 상대오차(relative error)로 나타내어 모델의 정확도를 검증하였다. 각 반응변수에 대한 반응모델의 정확 도를 검증하여 추출조건에 따른 반응을 설명하는데 적합하다고 판단되면 모든 반응변수를 최적화할 수 있는 하나의 추출조건을 설정하였다.
- 각 최적 추출조건은 Table 6과 같으며, 예측된 최적 추출조건에서 실제 추출 및 실험을 수행하여 예측된 값과 실제 실험값의 비교를 통하여 모델의 정확도를 검증하였다. 예측 값과 실험 값의 차이는 상대오차를 통해 표현하였다. 상대오차는 추출 수율이 0.
이론/모형
- ABTS 자유 라디칼 소거능은 Re 둥(14)의 방법에 따라 측정하였다. 7mM의 ABTS diammounium salt를 증류수에 용해시켜 만 든 용액과 2.
- Mushroom p-glucan kit에서 제공한 방법에 따라 이 kit를 사용하여 종 glucan과 a-glucan 함량을 측정하고 a잉ucan 함량을 제외한 나머지를 p-glucan의 함량으로 계산하였다. P-1,3-Glucan의 함량 분석은 P-1,3-glucan의 p-1,3 결합에 aniline blue 염색약이 반 응하여 fluorescence가 발현되는 현상을 이용한 Ko와 Lin(16)의 방법으로 측정하였다. 시료를 1N NaOH로 희석하여 300 皿를 취 해 1.
- 각 반응변수의 최적 추출조건은 Minitab software의 ‘response optimizer’를 이용하여 예측하였다. 각 최적 추출조건은 Table 6과 같으며, 예측된 최적 추출조건에서 실제 추출 및 실험을 수행하여 예측된 값과 실제 실험값의 비교를 통하여 모델의 정확도를 검증하였다.
- 각 시료의 총 폴리페놀 함량은 Folin-Ciocalteu 시약을 이용한 Singleton 등(13)의 방법을 이용하여 분석하였다. 시료의 농도는 gallic acid를 표준물질로 사용하여 작성한 검량선의 범위가 되도록 물에 희석하였다.
- 세 가지의 독립변수(인자)로 에탄올 농도(X1, % (v/v)), 추출온 도(总, oC), 추출시간(类 h)을 사용하여 반응표면분석법 중 중심 합성계획법(central composite design)을 이용하였다. 실험 범위에 따라 부호화된 독립변수와 코드화되지 않은 독립변수는 Table 1과 같다.
성능/효과
- 01 수준에서 유의하였다(Table 4). 총 폴리페놀 함량은 추출 온도가 높아지고 추출 시간이 길어짐 에 따라 증가하였고, 회귀 분석 결과, 추출 온도(為)와 추출 온도 의 이차항(#)이 "<0.01 수준에서 유의하였다(Table 5). 본 연구의 결과는 노랑느타리 버섯에서 추출 시간과 에탄올 농도가 총 폴리페놀 함량에 유의적인 영향을 주지 않는다는 보고와 일치하 였으나(18), 송이버섯에서 추출 온도와 추출 용매의 비율이 유의적으로 총 폴리페놀 함량에 영향을 미친다는 보고(19)와는 다른 경향을 나타내었다.
- 이는 추출 온도가 높아지면 용매가 활발히 환류하여 추출량이 증가한 것으로 생각한다. ABTS free radical scavanging activity와 ORAC의 반응표면그래프와 등고선도는 9.2%의 에 탄올 함량과 92.7oC의 추출 온도에서 최대값이 나타나는 형태로 예측되었으며, 반응표면그래프와 등고선도에 따른 항산화능의 최대 추출조건은 총 폴리페놀의 함량의 최대 추출조건과 일치하였다.。-1,3-Glucan 함량의 반응표면그래프와 등고선도는 다른 반응 변수와 달리 반응표면그래프에 최저값이 나타났으며 에탄올 함 량에 따라 큰 차이를 보였다.
- ABTS 자유 라디칼 소거능은 실험 조건 16번(Xi： 50%, %: 92.7oC, %: 8 h)에서 최대 (980±30mM TEAC/mg)이었고, 실험 조 건 17번(%: 50%, %: 60oC, %: 1.5分에서 최소(284±27mM TEAC/mg)이었다(Table 3). 이차 회귀식의 R2 값은 0.
- 。-1,3-Glucan 함량의 반응표면그래프와 등고선도는 다른 반응 변수와 달리 반응표면그래프에 최저값이 나타났으며 에탄올 함 량에 따라 큰 차이를 보였다. P-1,β-glucane 에탄올 함량이 26% 이하일 때 추출되지 않을 것으로 예측되었고, 실제 실험에서는 에탄올 함량 50% 미만의 추출조건에서 추출한 시료에서는 측정되지 않았다. 따라서 日-1,3잉ucan의 추출에 가장 큰 영향을 미치는 것은 에탄올 농도임을 알 수 있으며, 열수 추출법을 이용하면 6-1,3-gucan이 함유된 차가버섯 분말 제조에 어려움이 있을 것으로 판단된다
- 5%였다. 각 반응 변수에서 유의적인 이차 회 귀식을 얻었으며, 예측 값과 실험 값의 오차가 크지 않아 반응표 면모델이 최적 추출조건을 예측하는데 적합하다고 판단하였으며 , 다섯 가지 반응 변수를 통합하는 최적 추출조건은 81.4%, 92.7oC, 14.5h으로 예측하였다. 본 연구는 주로 열수추출물의 형태로 유 통되는 차가버섯 추출물의 품질 개선을 위하여 에탄올 용매를 포함한 최적 추출조건을 설정하였고, 구체적인 추출 수율과 생리활 성물질 함량 및 항산화능이 최대가 되는 추출조건을 제시하였다.
- 추출 수율, 총 폴리페놀 함량 항산화능(ABTS 자유 라디칼 소거능, ORAC), p-1,3-glucan 함량의 총 다섯 가지 반응변수에서 유의적인 이차 회귀식을 얻 었고, 반응표면그래프와 둥고선도를 통하여 최적 추출조건을 예 측하였다. 각 반응변수에 따른 최적 추출조건은 추출 수율에서 50% (v/v), 88.7oC, 14.5 h, 총 폴리페놀 함량에서 9.2%, 92.7oC, 14.5 h, ABTS free radical scavanging activity에서 50.8%, 92.7oC, 14.5h, ORAC에서 9.2%, 92.7oC, 1.5 h, P-1,3-glucan 함량에서 90.8%, 92.7oC, 1.5h으로 예측되었다. 각 반응변수의 예측 최 대추출조건에서 실제 실험을 실행하여 예측 값과 비교해본 결과 , 상대오차는 0.
- 5h으로 예측되었다. 각 반응변수의 예측 최 대추출조건에서 실제 실험을 실행하여 예측 값과 비교해본 결과 , 상대오차는 0.4-12.5%였다. 각 반응 변수에서 유의적인 이차 회 귀식을 얻었으며, 예측 값과 실험 값의 오차가 크지 않아 반응표 면모델이 최적 추출조건을 예측하는데 적합하다고 판단하였으며 , 다섯 가지 반응 변수를 통합하는 최적 추출조건은 81.
- 5%로 가장 높았다(Table 6). 결론적으로 각 반응변수의 이차 회귀식이 유의하고, 예측 값과 실험 값의 오차가 크지 않아 각 반응표면모델이 추출조건에 따른 반응변수를 설명하는데 적합하 다고 판단하였다. 이에 다섯 가지의 반응 변수를 모두 고려하면 에탄올 농도 81.
- P-1,β-glucane 에탄올 함량이 26% 이하일 때 추출되지 않을 것으로 예측되었고, 실제 실험에서는 에탄올 함량 50% 미만의 추출조건에서 추출한 시료에서는 측정되지 않았다. 따라서 日-1,3잉ucan의 추출에 가장 큰 영향을 미치는 것은 에탄올 농도임을 알 수 있으며, 열수 추출법을 이용하면 6-1,3-gucan이 함유된 차가버섯 분말 제조에 어려움이 있을 것으로 판단된다
- 예측 값과 실험 값의 차이는 상대오차를 통해 표현하였다. 상대오차는 추출 수율이 0.4%로 가장 낮았고, ORAC이 12.5%로 가장 높았다(Table 6). 결론적으로 각 반응변수의 이차 회귀식이 유의하고, 예측 값과 실험 값의 오차가 크지 않아 각 반응표면모델이 추출조건에 따른 반응변수를 설명하는데 적합하 다고 판단하였다.
- 총 폴리페놀 함량은 실험 조건 16번(X1: 50%, X；: 92.7oC, X3: 8h)에서 최대(329±18mg GAE/g)였으며, 실험 조건 6번(X1: 75%, X,: 40oC, %: 12h)에서 최소(71±3mg GAE/g)였다(Table 3). 이차 회귀식의 R2 값은 0.
- 총 폴리페놀 함량의 반응표면그래프는 추출 수율과 비교 할 때 뒤집힌 능선형을 나타내었다. 총 폴리페놀 함량은 추출 온 도가 40-60oC일 때 가장 낮았고 추출 온도가 40oC 이하일 때보다 추출 온도가 60oC 이상일 때 더 많은 양이 추출될 것으로 예 측되었다. 이는 추출 온도가 높아지면 용매가 활발히 환류하여 추출량이 증가한 것으로 생각한다.
- 추출 수율은 실험 조건 14번(X1: 90.8%, %: 60oC, X3: 8h)에서 가장 낮았고(4.7±0.3%), 실험 조건 16번(X1: 50%, %: 92.7oC, X3: 8 h)에서 26.3±0.7%로 가장 높았다(Table 3). 이는 에탄올 함량이 가장 높은 용매를 사용한 추출조건에서 추출 수율이 최저로 나타난 선행연구의 결과와 일치하였다(17,18).
- 1). 추출 수율의 반응표면그래프와 등고선도는 능선형으로 나타나, 추출 수율의 최대값은 에탄올 함량 50% 이상, 추출 온도 92.7oC 이상의 추출조건에 존재할 것으로 예측되었다. 추출 수 율은 에탄올 함량의 비율이 높아질수록 급격히 감소하는 것으로 예측되어, 차가버섯을 에탄올 함량이 높은 용액으로 추출하면 추출 수율이 매우 낮아지므로 산업적으로 효율적이지 않다고 생 각한다.
- 회귀 분석 결과, 추출 시간의 이 차항(%2)이 p<001 수준에서 유의하였다(Table 5). 항산화능을 나타내는 지표인 ABTS free radical scavanging activity와 ORAC 은 추출 시간이 반응 변수에 유의적인 영향을 미치는 것으로 나타났다.
- 05 수준에서 유의하였다(Table 4). 회귀 분석 결과, 추출 시간의 이 차항(%2)이 p<001 수준에서 유의하였다(Table 5). 항산화능을 나타내는 지표인 ABTS free radical scavanging activity와 ORAC 은 추출 시간이 반응 변수에 유의적인 영향을 미치는 것으로 나타났다.
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