녹차 성숙잎으로부터 새로운 면역 활성 다당 소재를 개발할 목적으로 녹차잎을 pectinase로 처리하여 조다당 GTE-0을 분리하고 이들의 면역증진 활성과 화학적 특성에 대해 조사하였다. GTE-0은 중성당 54.9%, 산성당 45.1%로 이루어져 있었으며, 구성당 분석 결과 주로 glucose(14.2%), arabinose(12.2%), rhamnose(11.1%) 및 galactose(7.3%)로 구성되어 있었다. 한편 GTE-0은 비특이적 면역계에 있어 중요한 역할을 담당하고 있는 보체계에 대하여 양성대조군 PSK에 준하는 우수한 활성이 농도 의존적으로 나타났다. 또한 GTE-0을 처리하고 검경 시 형태적으로 구분이 가능한 활성화된 대식세포의 숫자가 증가되는 경향을 보였다. 대식세포의 NO, ROS 및 $H_2O_2$ 생산에 미치는 GTE-0의 효과를 검토한 결과 ROS와 $H_2O_2$는 모두 농도 의존적으로 생산량을 증가시키는 우수한 활성을 나타낸 반면, NO의 생산능은 1,000 mg/mL의 고농도에서보다 오히려 100 mg/mL의 저농도에서 더 우수한 활성을 나타내었다. 또한 GTE-0으로 자극한 대식세포는 무처리 대조군에 비해 IL-6, IL-12 및 TNF-${\alpha}$와 같은 다양한 cytokine들의 생산이 농도 의존적으로 증가되는 경향을 보였다. 대식세포의 식작용 활성을 측정한 결과 무처리 대조군에 비해 GTE-0 100 mg/mL 농도이상 처리하였을 때 우수한 활성을 나타내었다. 또한 활성화된 대식세포의 YAC-1 종양세포주에 대한 치사 활성을 ex vivo로 측정한 결과 100 mg/mL의 농도에서 무처리군 대비 유의적으로 높은 치사 활성을 보였다. 이상의 결과로부터 녹차 성숙잎으로부터 분리된 효소 처리 조다당 GTE-0은 강력한 면역 활성 증진 효과를 갖고 있음을 결론지을 수 있었다.
녹차 성숙잎으로부터 새로운 면역 활성 다당 소재를 개발할 목적으로 녹차잎을 pectinase로 처리하여 조다당 GTE-0을 분리하고 이들의 면역증진 활성과 화학적 특성에 대해 조사하였다. GTE-0은 중성당 54.9%, 산성당 45.1%로 이루어져 있었으며, 구성당 분석 결과 주로 glucose(14.2%), arabinose(12.2%), rhamnose(11.1%) 및 galactose(7.3%)로 구성되어 있었다. 한편 GTE-0은 비특이적 면역계에 있어 중요한 역할을 담당하고 있는 보체계에 대하여 양성대조군 PSK에 준하는 우수한 활성이 농도 의존적으로 나타났다. 또한 GTE-0을 처리하고 검경 시 형태적으로 구분이 가능한 활성화된 대식세포의 숫자가 증가되는 경향을 보였다. 대식세포의 NO, ROS 및 $H_2O_2$ 생산에 미치는 GTE-0의 효과를 검토한 결과 ROS와 $H_2O_2$는 모두 농도 의존적으로 생산량을 증가시키는 우수한 활성을 나타낸 반면, NO의 생산능은 1,000 mg/mL의 고농도에서보다 오히려 100 mg/mL의 저농도에서 더 우수한 활성을 나타내었다. 또한 GTE-0으로 자극한 대식세포는 무처리 대조군에 비해 IL-6, IL-12 및 TNF-${\alpha}$와 같은 다양한 cytokine들의 생산이 농도 의존적으로 증가되는 경향을 보였다. 대식세포의 식작용 활성을 측정한 결과 무처리 대조군에 비해 GTE-0 100 mg/mL 농도이상 처리하였을 때 우수한 활성을 나타내었다. 또한 활성화된 대식세포의 YAC-1 종양세포주에 대한 치사 활성을 ex vivo로 측정한 결과 100 mg/mL의 농도에서 무처리군 대비 유의적으로 높은 치사 활성을 보였다. 이상의 결과로부터 녹차 성숙잎으로부터 분리된 효소 처리 조다당 GTE-0은 강력한 면역 활성 증진 효과를 갖고 있음을 결론지을 수 있었다.
In order to develop new immuno-stimulating ingredients from mature leaves of green tea, crude polysaccharides were isolated from pectinase digests of tea leaves (green tea enzyme digestion, GTE-0), after which their immuno-stimulating activities and chemical properties were examined. GTE-0 mainly co...
In order to develop new immuno-stimulating ingredients from mature leaves of green tea, crude polysaccharides were isolated from pectinase digests of tea leaves (green tea enzyme digestion, GTE-0), after which their immuno-stimulating activities and chemical properties were examined. GTE-0 mainly contained neutral sugars (54.9%) such as glucose (14.2%), arabinose (12.2%), rhamnose (11.1%), and galacturonic acid (45.1%), which are characteristic of pectic polysaccharides. The anti-complementary activity of GTE-0 was similar to that of polysaccharide K (used as positive control). Number of morphologically activated macrophages was significantly increased in the GTE-0-treated group. GTE-0 significantly augmented $H_2O_2$ and reactive oxygen species production by murine peritoneal macrophage cells in a dose-dependent manner, whereas production of nitric oxide showed the highest activity at a dose of $100{\mu}g/mL$ among all tested concentrations. Murine peritoneal macrophages stimulated with GTE-0 showed enhanced production of various cytokines such as interleukin (IL)-6, IL-12, and tumor necrosis factors-${\alpha}$ in a dose-dependent manner. Further, GTE-0 induced higher phagocytic activity in a dose-dependent manner. In ex vivo assay for cytolytic activity of murine peritoneal macrophages, GTE-0-treated group showed significantly higher activity compared to the untreated group at an effector-to-target cell ratio of 20. The above results lead us to conclude that polysaccharides from leaves of green tea have a potent immuno-stimulating effect on murine peritoneal macrophage cells.
In order to develop new immuno-stimulating ingredients from mature leaves of green tea, crude polysaccharides were isolated from pectinase digests of tea leaves (green tea enzyme digestion, GTE-0), after which their immuno-stimulating activities and chemical properties were examined. GTE-0 mainly contained neutral sugars (54.9%) such as glucose (14.2%), arabinose (12.2%), rhamnose (11.1%), and galacturonic acid (45.1%), which are characteristic of pectic polysaccharides. The anti-complementary activity of GTE-0 was similar to that of polysaccharide K (used as positive control). Number of morphologically activated macrophages was significantly increased in the GTE-0-treated group. GTE-0 significantly augmented $H_2O_2$ and reactive oxygen species production by murine peritoneal macrophage cells in a dose-dependent manner, whereas production of nitric oxide showed the highest activity at a dose of $100{\mu}g/mL$ among all tested concentrations. Murine peritoneal macrophages stimulated with GTE-0 showed enhanced production of various cytokines such as interleukin (IL)-6, IL-12, and tumor necrosis factors-${\alpha}$ in a dose-dependent manner. Further, GTE-0 induced higher phagocytic activity in a dose-dependent manner. In ex vivo assay for cytolytic activity of murine peritoneal macrophages, GTE-0-treated group showed significantly higher activity compared to the untreated group at an effector-to-target cell ratio of 20. The above results lead us to conclude that polysaccharides from leaves of green tea have a potent immuno-stimulating effect on murine peritoneal macrophage cells.
* AI 자동 식별 결과로 적합하지 않은 문장이 있을 수 있으니, 이용에 유의하시기 바랍니다.
문제 정의
그러나 녹차에 존재하는 펙틴류 다당에 관한 면역 활성에 대한 보고는 거의 전무한 실정에 있다. 따라서 본 연구에서는 녹차 제품으로 가공하기 힘든 등외품 녹차 성숙잎을 이용하여 pectinase 처리에 의해 homo- galacturonan 부분을 분해하여 면역 활성이 우수한 다당체를 분리하고 이들의 항보체 활성 및 대식세포의 면역기능활성 효과를 확인함으로써 녹차 다당의 고부가가치 기능성소재로서의 이용방안을 모색하고자 하였다.
제안 방법
5시간 가수분해하여 각각 alditol acetate 유도체(16)로 전환시킨 후 GC로 분석하였다. GC의분석은 SP-2380 capillary column(0.2 ym film, 0.25 mm X30 m, Supelco, Bellefonte, PA, USA)이 장착된 GC ACME-6100(Young-Lin Co. Ltd., Anyang, Korea)을 이용하였으며, 표준온도조건[60℃(1 min), 60℃e220℃(30 ℃/min), 220℃(12 min), 220℃e250℃(8℃/min), 250 ℃(15 min)]에서 분석을 실시하였다. 구성당의 mole%는 peak의 면적비, flame ionization detector(FID)에 대한 반응계수 및 각 구성당의 alditol acetate 유도체의 분자량으로부터 계산하였다.
GTE-0에 의해 활성화된 macrophage를 얻기 위해 5% TG 2 mL를 복강 내 주입하여 24시간 동안 세포를 배양한후, 100 ug/mL의 GTE-0 시료를 200 uL 투여하여 48시간동안 활성화된 effector cell인 macrophage cell을 얻었다. Effector cell에 의한 세포독성 효과를 측정하기 위한 암세포(target cell)는 YAC-1을 사용하였다.
GTE-0의 활성화 여부를 측정하기 위해 GTW-0과 비교, 항보체 활성을 측정하였다. 양성대조군으로는 운지버섯 (Coriolus versicolor) 유래 면역 활성 다당체인 PSK(poly- saccharide-K)를 사용하였으며(30), 음성대조군으로는 시료를 첨가하지 않은 증류수를 이용하였다.
비부착된 세포는 MEM 배지를이용하여 세척하고 제거한 후, 100 ug/mL의 농도로 GTE- 0 시료를 조제하여 가한 다음 48시간 배양하였다. Slide glass는 PBS로 세척 후 Bouin's solution(Sigma-Aldrich Co.)으로 5분 동안 고정시켜준 다음 Giemsa stain으로 2시간 동안 염색하였으며, acetone으로 탈수 후 광학현미경 (Olympus BX40, Tokyo, Japan)으로 400배 시야 5곳에서활성화된 macrophage를 계수하였다(19).
구성당 분석은 다당 시료를 2 M trifluoro-acetic acid (TFA)로 121℃에서 1.5시간 가수분해하여 각각 alditol acetate 유도체(16)로 전환시킨 후 GC로 분석하였다. GC의분석은 SP-2380 capillary column(0.
, Anyang, Korea)을 이용하였으며, 표준온도조건[60℃(1 min), 60℃e220℃(30 ℃/min), 220℃(12 min), 220℃e250℃(8℃/min), 250 ℃(15 min)]에서 분석을 실시하였다. 구성당의 mole%는 peak의 면적비, flame ionization detector(FID)에 대한 반응계수 및 각 구성당의 alditol acetate 유도체의 분자량으로부터 계산하였다.
녹차 성숙잎 유래 다당에 의한 macrophage 활성화를 현미경 검정하여 형태적으로 관찰한 다음 활성화된 macro- phage(Fig. 2A)를 계수하고 결과를 산출하였다. 일반적으로 대식세포는 시료에 의해 활성화할 경우 세포질의 부피가증가하고 상대적으로 밝고 근 핵이 관찰되며, 세포 표면에위족(pseudo-leg)의 돌출이 많아지고 이들이 glass 표면위에서 잘 펼쳐지는(spreading) 형태적 특징을 보인다고 알려져 있다(19).
Pectin류에서 관찰되는 면역증진 활성을 포함한 대부분의약리활성(26)은 HG main chain에서는 거의 보고된 바 없고, 주로 복잡한 구조의 RG- I 과 RG-U 의 미세구조의 차이에 기인한 것으로 알려지고 있다(27). 따라서 본 연구진은높은 약리활성을 소유한 RG-I 및 RG-n 다당이 풍부한획분을 선택적으로 조제하기 위해 pectinase 처리로 HG 부분을 제거하고 본 실험에 사용하였다.
2B) 무처리 대조군에 비해약 25% 이상 활성화 대식세포 수가 증가한 결과를 보여 주었는데, 이는 macrophage 표면에 존재하는 특정 수용체에다당 분자가 인식되면서 활성화되었다고 생각된다. 따라서녹차 유래 다당의 대식세포 활성화를 확인하고 이후 대식세포 관련 면역 활성 실험을 진행하였다.
상기에 제시된 방법으로 세포를 24시간 배양하여 원심분리(900 rpm, 4℃, 5분) 한 후 세포 배양액을 회수하여 생산된 cytokine 분비능을 확인하였다. Macrophage에 의해 유도, 분비된 배양 상등액 중의 cytokines(IL-6, IL-12 및 TNF-a) 함량은 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit(BD Bio-Sciences, San Diego, CA, USA)을이용, 제조사의 지침에 따라 측정하였다.
상기에 제시된 방법으로 세포수를 2X105 cells/well로조정하여 24시간 동안 세포를 배양한 후 Escherichia coli 와 fluorescein이 결합된 fluorescent particles(Invitrogen) 을 effector cell과 target cell의 비율(E/T ratio)이 10, 20 이 되도록 조정하여 100 uL씩 분주한 뒤 37℃, 5% CO2 incubator에서 60분 동안 배양하였다. 이를 5번 PBS로 세척하고 lysis buffer를 100 uL씩 넣고 60분 후에 365 nm와 450 nm에서 RFU를 측정하였다.
상기에 제시된 방법으로 세포수를 2X105 cells/well로조정하여 세포를 24시간 배양하고, macrophage에 의해 유도, 분비된 세포 배양액을 원심분리(900 rpm, 4℃, 5분) 후회수하여 배양액 중 생산된 NO(nitric oxide), HzOehy- drogen peroxide) 및 ROS(reactive oxygen species) 생산능을 확인하였다. 세포 배양액 내의 NO는 Griess re- agent(Promega Co.
5 mM glucose와 100 ng/mL phorbol myristic acetate(PMA)가포함된 용액을 100 uL씩 분주하고 37℃, 5% CO2 in- cubator에서 2시간 동안 배양 후 365 nm와 450 nm에서 relative fluorescence unit(RFU)을 측정하였다. 세포 내의 ROS 분비능 측정은 2', 7'-dichlorofluorescein diacetate (DCFH-DA, Invitrogen, Eugene, OR, USA)가 활성 산소에 의해 2', 7'-dichlorofluorescein(DCF)을 형성하는 반응을 이용, 배양 후의 세포에 10 uM의 DCFH-DA를 첨가하여 2시간 동안 배양시킨 후 세포를 용해시켜 상등액의 형광값을 형광측정기(Victor-2, PerkinElmer, Wellesley, MA, USA)를 이용해 excitation 450 nm, emission 530 nm에서측정하였다.
시료의 중성당 함량은 galactose를 표준물질로 하여 phenol-sulfuric acid법(12)으로, 산성당 함량은 galactur- onic acid를 표준물질로 하여 t刀-hydroxybiphenyl법(13) 으로, TBA-positive material의 함량은 2-keto-3-de- oxy-D-rnenno-octulosonic acid(KDO)를 표준물질로 하여 thiobarbituric acid법(14)으로, 단백질 함량은 표준물질로 bovine serum albumin을 사용하여 Bradford법(15)을실험실 여건에 맞게 변형하여 사용하였다.
또한 시료의 농도에 차이를두어 실험한 결과 농도 의존적인 활성임을 알 수 있었다. 이 결과로부터 GTE-0이 보체를 활성화시킬 수 있으며, 보체의 활성화산물에 의해 생체 내 대식세포 등의 면역세포를자극할 가능성이 예견되었으므로 이후 실험에서는 GTE-0 만을 이용하여 실험을 진행하였다.
배양완료 후 culture plate를 1,500 rpm에서 5분간 원심분리하여 세포 배양액 상등액을 100 uL 회수하였다. 이 상등액에 effector cell의 살해능에 의해 target cell로부터 유리되는 lactate dehydrogenase(LDH)를 LDH assay kit(Pro- mega, Oxford, MI, USA)을 사용하여 측정하였다. Macro- phage의 암세포 독성은 다음 식에 의해 계산하였다.
0, 50℃, 3일)하였고, 이를 6, 000 rpm에서 20분간 원심분리 하여 잔사를 제거하고 여기에 4 배(v/v) 부피의 95% ethan이을 가하여 24시간 교반하면서다당을 침전시켰다. 이때 발생한 침전물은 7, 000 rpm에서 30분간 원심분리 하여 침전물을 회수하고 이를 소량의 증류수에 용해시킨 후, dialysis tubing(MW cut-off 2, 000)을이용하여 2~3일간 투석을 행하고 이를 동결 건조하여 효소처리 조다당 획분, GTE-0(green tea enzyme digestion) 을 얻었다.
1%)가 높은 비율로 함유되어 있었고 자연계에서 거의발견되지 않는 2-O-methyl-fucose, 2-O-methyl-xylose, apiose, aceric acid와 같은 특이당이 미량 검출되었다. 이러한 사실은 pectinase 효소를 처리함으로써 pectin 형태로존재하는 다당에서 a-1, 4 결합의 GalA 중합체인 HG 영역이 절단되어 제거되고 GTE-0에는 pectin에 공유적으로 결합되어 있다고 보고되고 있는 hetero polysaccharide류인 RG-I 및 n 다당이 분리되어 이들의 혼합물 형태로 존재함을 추정하게 하였다.
단순 열수 추출물은 녹차 성숙잎 분말 100 g에 10배 부피의 증류수를 가하여 100℃에서 추출하였다. 이를 4배 부피의 95% ethan이을 가하고 침전물은 소량의증류수에 용해하여 투석 및 동결건조를 거쳐 녹차 성숙잎열수 추출 조다당 GTW-0(green tea hot water)을 얻었다. 이와 별도로 녹차 성숙잎 분말 100 g에 0.
이를 4배 부피의 95% ethan이을 가하고 침전물은 소량의증류수에 용해하여 투석 및 동결건조를 거쳐 녹차 성숙잎열수 추출 조다당 GTW-0(green tea hot water)을 얻었다. 이와 별도로 녹차 성숙잎 분말 100 g에 0.5% pectinase (from Aspergillus nigen Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA)를 처리(pH 5.0, 50℃, 3일)하였고, 이를 6, 000 rpm에서 20분간 원심분리 하여 잔사를 제거하고 여기에 4 배(v/v) 부피의 95% ethan이을 가하여 24시간 교반하면서다당을 침전시켰다. 이때 발생한 침전물은 7, 000 rpm에서 30분간 원심분리 하여 침전물을 회수하고 이를 소량의 증류수에 용해시킨 후, dialysis tubing(MW cut-off 2, 000)을이용하여 2~3일간 투석을 행하고 이를 동결 건조하여 효소처리 조다당 획분, GTE-0(green tea enzyme digestion) 을 얻었다.
(48) 또한 macrophage는 천연물이나 세균성 산물 등과 같이 다양한 자극이나 cytokine들에 의해 tumoricidal activ- ity가 활성화되는 것으로 알려져 있다(49). 종양세포주에 대한 대식세포의 치]사 효과를 확인하기 위하여 BALB/c mouse를 이용, 복강 macrophage를 유도하고 시료를 복강내로 투여하여 활성화시킨 후 이를 분리하여 tumor cell에대한 치사 활성을 ex ”Vo로 측정하였다. 그 결과 Fig.
Effector cell에 의한 세포독성 효과를 측정하기 위한 암세포(target cell)는 YAC-1을 사용하였다. 즉 flat-bottom 96-well microplate에 effector cell과 target cell의 비율 (E/T ratio)이 10, 20이 되도록 조정하여 분주 후, 37℃, 5% CO2 incubator에서 18~24시간 동안 배양하였다. 배양완료 후 culture plate를 1,500 rpm에서 5분간 원심분리하여 세포 배양액 상등액을 100 uL 회수하였다.
대상 데이터
6주령의 웅성 BALB/c mouse의 복강에 5% thioglycol- late(TG) 배지(Sigma-Aldrich Co.)를 2 mL 주입하고 72시간 동안 유도된 macrophage를 회수한 후 MEM 배지로 2~3회 세척하고, 세포수를 4X105 cells/mL로 조정하여 slide glass 위에 seeding 하고 30분 동안 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양하였다. 비부착된 세포는 MEM 배지를이용하여 세척하고 제거한 후, 100 ug/mL의 농도로 GTE- 0 시료를 조제하여 가한 다음 48시간 배양하였다.
얻었다. Effector cell에 의한 세포독성 효과를 측정하기 위한 암세포(target cell)는 YAC-1을 사용하였다. 즉 flat-bottom 96-well microplate에 effector cell과 target cell의 비율 (E/T ratio)이 10, 20이 되도록 조정하여 분주 후, 37℃, 5% CO2 incubator에서 18~24시간 동안 배양하였다.
본 실험에서 사용된 녹차 성숙잎은 2010년 7월 경상남도하동군에서 수확한 녹차의 성숙잎을 하동군청으로부터 제공받아 실험에 사용하였다.
생후 5~6주령의 웅성 BALB/c를 G-Bio(Seoul, Korea) 에서 구입하여 3일간 적응을 거친 후 실험에 사용하였다. Mouse는 사육조에 5~10마리씩 넣어 온도 23±3℃, 습도 55~70%에서 사육하였으며 물과 사료는 자유 급식 형태로유지하였다.
활성을 측정하였다. 양성대조군으로는 운지버섯 (Coriolus versicolor) 유래 면역 활성 다당체인 PSK(poly- saccharide-K)를 사용하였으며(30), 음성대조군으로는 시료를 첨가하지 않은 증류수를 이용하였다. 음성대조군에서의 활성화 정도를 ITCH50 0%로 하여 GTE-0과 GTW-0의활성화능을 확인한 결과(Fig.
데이터처리
, Chicago, IL, USA) 을 사용하여 통계 처리하였으며 평균값士표준편차(mean士 SD)로 나타내었다. 시료 간 및 처리 농도 간 유의성은 twoway ANOVA 실시한 다음 Duncan's multiple range test로사후 검정을 실시하여 尸 V0.05 수준에서 유의성을 검증하였다.
실험 결과는 SPSS 20.0(SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 을 사용하여 통계 처리하였으며 평균값士표준편차(mean士 SD)로 나타내었다. 시료 간 및 처리 농도 간 유의성은 twoway ANOVA 실시한 다음 Duncan's multiple range test로사후 검정을 실시하여 尸 V0.
이론/모형
cytokine 분비능을 확인하였다. Macrophage에 의해 유도, 분비된 배양 상등액 중의 cytokines(IL-6, IL-12 및 TNF-a) 함량은 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit(BD Bio-Sciences, San Diego, CA, USA)을이용, 제조사의 지침에 따라 측정하였다.
보체계의 활성화(항보체 활성, anti-complementary ac- tivity)는 Mayer법(17)을 이용하여 시료에 의한 보체 활성화 후, 잔존하는 보체에 의한 적혈구 용혈 활성에 근거를 둔 complement fixation test로 즉정하였다. 즉 정상인의 혈청과 2% gelatin, 3 mM Ca2+, 10 mM Mg2+이 함유된 GVB2+ 완충용액(gelatin veronal buffered saline, pH 7.
확인하였다. 세포 배양액 내의 NO는 Griess re- agent(Promega Co., Madison, WI, USA)를 이용, 제조사의 지침에 따라 측정하였다. 세포 내의 足。2(20)는 Krebs- Ringer phosphate buffer(pH 7.
성능/효과
5에서나타난 바와 같이 시료를 처리하지 않은 정상군의 macro- phage에 비해 100 ug/mouse의 GTE-0을 복강 내 투여하여 얻은 활성화된 macrophage는 YAC-1 종양세포주에 대해 약 3배 정도의 치사 활성을 보였으며, 그 활성이 유의적으로 높은 것을 확인할 수 있었다. 이는 GTE-0에 의해 대식세포가 직접적으로 활성화되면 IL-1。, TNF-a, IL-12 등과같은 cytokine이 분비되어 암세포의 증식이나 전이를 억제하거나 암세포를 살해하는 활성을 증진시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.
Anti-complementary activity of the two crude polysaccharides (GTW-0 and GTE-0) isolated from the mature tea leaves of Camellia sinensis. 1)Anti-complementary activity was presented as the inhibition of 50% total complement hemolysis by Mayer's method. 2)Polysaccharide-K (PSK), a known im- muno-active polysaccharide from Coriolus versicolor was used as a positive control (PC) and distilled water as negative control (NC).
또한 대식세포의 활성을 측정하는데 유용한 도구로작용한다고 알려져 있다. GTE-0에 의해 활성화된 대식세포의 식세포 작용 활성을 평가한 결과(Fig. 4) GTE-0 처리군은 무처리군보다 농도 의존적으로 약간 높은 활성을 보였으며, 1,000 ug/mL에서 최대 활성을 보였다.
GTE-0을 다양한 농도로 처리하여 macrophage 세포의 NO 생산능을 측정한 결과(Table 2) 모든 농도에서 대조군보다 우수한 생산능을 나타내었으며, 특히 1,000 mg/mL의고농도보다 100 mg/mL의 저농도에서 대조군보다 NO 생산이 약 10배 정도 우수하였다. ROS와 H2O2의 생산능은 모두 GTE-0 1,000 mg/mL의 고농도에서 대식세포로부터 ROS 와 H2O2 생산을 농도 의존적으로 증가시키는 것이 확인되었다(Table 2).
GTE-0의 자극에 의한 macrophage의 cytokine 생산을 in 以ro에서 측정한 결과(Fig. 3.) IL-6, IL-12 및 TNF-a 의 생산을 촉진하였다. IL-6(Fig.
) IL-6, IL-12 및 TNF-a 의 생산을 촉진하였다. IL-6(Fig. 3A)과 IL-12(Fig. 3B)의경우 모두 농도 의존적인 생산량의 증가가 관찰되었고, 특히 100 mg/mL 이상의 농도에서의 활성은 양성대조군인 LPS 에 상당하는 높은 활성이었다. 또한 TNF-a(Fig.
약 10배 정도 우수하였다. ROS와 H2O2의 생산능은 모두 GTE-0 1,000 mg/mL의 고농도에서 대식세포로부터 ROS 와 H2O2 생산을 농도 의존적으로 증가시키는 것이 확인되었다(Table 2). 이상의 결과로부터 판단할 때 GTE-0은 대식세포로부터 NO, ROS 및 H2O2의 생산을 유도하여 면역기능활성화에 기여할 가능성이 있음이 추정되었다.
종양세포주에 대한 대식세포의 치]사 효과를 확인하기 위하여 BALB/c mouse를 이용, 복강 macrophage를 유도하고 시료를 복강내로 투여하여 활성화시킨 후 이를 분리하여 tumor cell에대한 치사 활성을 ex ”Vo로 측정하였다. 그 결과 Fig. 5에서나타난 바와 같이 시료를 처리하지 않은 정상군의 macro- phage에 비해 100 ug/mouse의 GTE-0을 복강 내 투여하여 얻은 활성화된 macrophage는 YAC-1 종양세포주에 대해 약 3배 정도의 치사 활성을 보였으며, 그 활성이 유의적으로 높은 것을 확인할 수 있었다. 이는 GTE-0에 의해 대식세포가 직접적으로 활성화되면 IL-1。, TNF-a, IL-12 등과같은 cytokine이 분비되어 암세포의 증식이나 전이를 억제하거나 암세포를 살해하는 활성을 증진시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.
일반적으로 대식세포는 시료에 의해 활성화할 경우 세포질의 부피가증가하고 상대적으로 밝고 근 핵이 관찰되며, 세포 표면에위족(pseudo-leg)의 돌출이 많아지고 이들이 glass 표면위에서 잘 펼쳐지는(spreading) 형태적 특징을 보인다고 알려져 있다(19). 녹차 유래 효소 처리 다당을 100 ug/mL 농도로 처리하여 검경한 결과(Fig. 2B) 무처리 대조군에 비해약 25% 이상 활성화 대식세포 수가 증가한 결과를 보여 주었는데, 이는 macrophage 표면에 존재하는 특정 수용체에다당 분자가 인식되면서 활성화되었다고 생각된다. 따라서녹차 유래 다당의 대식세포 활성화를 확인하고 이후 대식세포 관련 면역 활성 실험을 진행하였다.
3B)의경우 모두 농도 의존적인 생산량의 증가가 관찰되었고, 특히 100 mg/mL 이상의 농도에서의 활성은 양성대조군인 LPS 에 상당하는 높은 활성이었다. 또한 TNF-a(Fig. 3C)의 경우농도 의존적인 생산량의 증가가 관찰되었지만, 100 mg/mL의 농도 이상에서는 GTE-0의 생산량이 급격히 증가됨을확인할 수 있었다.
1), GTE-0 1,000 mg/mL의고농도에서 동일 농도를 가한 양성대조군에 준하는 56%의우수한 항보체 활성을 보였으며, GTW-0보다 GTE-0이 훨씬 높은 활성을 가지고 있었다. 또한 시료의 농도에 차이를두어 실험한 결과 농도 의존적인 활성임을 알 수 있었다. 이 결과로부터 GTE-0이 보체를 활성화시킬 수 있으며, 보체의 활성화산물에 의해 생체 내 대식세포 등의 면역세포를자극할 가능성이 예견되었으므로 이후 실험에서는 GTE-0 만을 이용하여 실험을 진행하였다.
본 실험에서 GTE-0에 의해 macrophage 생산을 자극한결과 염증 부위에 면역세포의 귀소와 직접 관련이 있는 염증성 cytokine으로 분류되는 IL-6과 TNF-a의 생산 및 세포성 면역능의 활성화와 직접 관련이 있는 IL-12를 유의하게생산하는 활성이 있음이 확인되었으므로 GTE-0은 생체방어에 작용하는 macrophage 수용체에 결합한 다음 세포 내신호전달을 유도하여 핵 내에서 cytokine을 유도시키는 기능이 있다고 판단되었다.
양성대조군으로는 운지버섯 (Coriolus versicolor) 유래 면역 활성 다당체인 PSK(poly- saccharide-K)를 사용하였으며(30), 음성대조군으로는 시료를 첨가하지 않은 증류수를 이용하였다. 음성대조군에서의 활성화 정도를 ITCH50 0%로 하여 GTE-0과 GTW-0의활성화능을 확인한 결과(Fig. 1), GTE-0 1,000 mg/mL의고농도에서 동일 농도를 가한 양성대조군에 준하는 56%의우수한 항보체 활성을 보였으며, GTW-0보다 GTE-0이 훨씬 높은 활성을 가지고 있었다. 또한 시료의 농도에 차이를두어 실험한 결과 농도 의존적인 활성임을 알 수 있었다.
ROS와 H2O2의 생산능은 모두 GTE-0 1,000 mg/mL의 고농도에서 대식세포로부터 ROS 와 H2O2 생산을 농도 의존적으로 증가시키는 것이 확인되었다(Table 2). 이상의 결과로부터 판단할 때 GTE-0은 대식세포로부터 NO, ROS 및 H2O2의 생산을 유도하여 면역기능활성화에 기여할 가능성이 있음이 추정되었다.
1%를 함유하고 있었다. 한편 GTE-0을 가수분해하여 alditol acetate 유도체로 전환하고 구성당을 분석한 결과 12종의 구성당이 분석되었으며, glucose(14.2%), arabinose(12.2%), rhamnose (11.1%)가 높은 비율로 함유되어 있었고 자연계에서 거의발견되지 않는 2-O-methyl-fucose, 2-O-methyl-xylose, apiose, aceric acid와 같은 특이당이 미량 검출되었다. 이러한 사실은 pectinase 효소를 처리함으로써 pectin 형태로존재하는 다당에서 a-1, 4 결합의 GalA 중합체인 HG 영역이 절단되어 제거되고 GTE-0에는 pectin에 공유적으로 결합되어 있다고 보고되고 있는 hetero polysaccharide류인 RG-I 및 n 다당이 분리되어 이들의 혼합물 형태로 존재함을 추정하게 하였다.
참고문헌 (49)
Hoebe K, Janssen E, Beutler B. 2004. The interface between innate and adaptive immunity. Nat Immunol 5: 971-974.
Birk RW, Gratchev A, Hakiy N, Politz O, Schledzewski K, Guillot P, Orfanos CE, Goerdt S. 2001. Alternative activation of antigen-presenting cells: concepts and clinical relevance. Hautarzt 52: 193-200.
Booth JS, Nichani AK, Benjamin P, Dar A, Krieg AM, Babiuk LA, Mutwiri GK. 2007. Innate immune responses induced by classes of CpG oligodeoxynucleotides in ovine lymph node and blood mononuclear cells. Vet Immunol Immunopathol 115: 24-34.
Klimp AH, de Vries EG, Scherphof GL, Daemen T. 2002. A potential role of macrophage activation in the treatment of cancer. Crit Rev Oncol Hematol 44: 143-161.
Lingen MW. 2001. Role of leukocytes and endothelial cells in the development of angiogenesis in inflammation and wound healing. Arch Pathol Lab Med 125: 67-71.
Park YH, Won EK, Son DJ. 2002. Effect of pH on the stability of green tea catechins. J Fd Hyg Safety 17: 117-123.
Nakabayashi T, Ina K, Sakata K. 1994. Chemistry and function of green, black and oolong tea. Kogagu Press, Kawasaki, Japan. p 20-51.
Ahmad N, Feyes DK, Nieminen AL, Agarwal R, Mukhtar H. 1997. Green tea constituent epigallocatechin-3-gallate and induction of apoptosis and cell cycle arrest in human carcinoma cells. J Natl Cancer Inst 89: 1881-1886.
Kim SH, Lee MH, Jeong YJ. 2014. Current trends and development substitute tea and plan in the Korean green tea industry. Food Industry and Nutrition 19(1): 20-25.
Chen H, Zhang M, Xie B. 2005. Components and antioxidant activity of polysaccharide conjugate from green tea. Food Chem 90: 17-21.
Monobe M, Ema K, Kato F, Maeda-Yamamoto M. 2008. Immunostimulating activity of a crude polysaccharide derived from green tea (Camellia sinensis) extract. J Agric Food Chem 56: 1423-1427.
DuBois M, Gilles KA, Hamilton JK, Rebers PA, Smith F. 1956. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Anal Chem 28: 350-356.
Karkhanis YD, Zeltner JY, Jackson JJ, Carlo DJ. 1978. A new and improved microassay to determine 2-keto-3-deoxyoctonate in lipopolysaccharide of gram-negative bacteria. Anal Biochem 85: 595-601.
Bradford MM. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72: 248-254.
Jones TM, Albersheim P. 1972. A gas chromatographic method for the determination of aldose and uronic acid constituents of plant cell wall polysaccharides. Plant Physiol 49: 926-936.
Kabat EA, Mayer MM. 1971. Experimental immunochemistry. Thomas Publisher, Springfield, IL, USA. p 133-240.
Yamada H, Ra KS, Kiyohara H, Cyong JC, Otsuka Y. 1989. Structural characterization of an anti-complementary pectic polysaccharide from the roots of Bupleurum falcatum L. Carbohydr Res 189: 209-226.
Iacomini M, Serrato RV, Sassaki GL, Lopes L, Buchi DF, Gorin PA. 2005. Isolation and partial characterization of a pectic polysaccharide from the fruit pulp of Spondias cytherea and its effect on peritoneal macrophage activation. Fitoterapia 76: 676-683.
De la Harpe J, Nathan CF. 1985. A semi-automated microassay for $H_2O_2$ release by human blood monocytes and mouse peritoneal macrophages. J Immunol Methods 78: 323-336.
O'Neill M, Albersheim P, Darvill A. 1990. The pectic polysaccharides of primary cell walls. In Methods in Plant Biochemistry. Carbohydrates Academic, London, UK. p 415-441.
Engelsen SB, Cros S, Mackie W, Perez S. 1996. A molecular builder for carbohydrates: application to polysaccharides and complex carbohydrates. Biopolymers 39: 417-433.
Perez S, Rodriguez-Carvajal MA, Doco T. 2003. A complex plant cell wall polysaccharide: rhamnogalacturonan II. A structure in quest of a function. Biochimie 85: 109-121.
Keller R, Keist R, Wechsler A, Leist TP, van der Meide PH. 1990. Mechanisms of macrophage-mediated tumor cell killing: a comparative analysis of the roles of reactive nitrogen intermediates and tumor necrosis factor. Int J Cancer 46: 682-686.
Wang H, Actor JK, Indrigo J, Olsen M, Dasgupta A. 2003. Asian and Siberian ginseng as a potential modulator of immune function: an in vitro cytokine study using mouse macrophages. Clin Chim Acta 327: 123-128.
Rice PJ, Kelley JL, Kogan G, Ensley HE, Kalbfleisch JH, Browder IW, Williams DL. 2002. Human monocyte scavenger receptors are pattern recognition receptors for (1 $\rightarrow$ 3)-beta-D-glucans. J Leukoc Biol 72: 140-146.
Taylor PR, Brown GD, Reid DM, Willment JA, Martinez-Pomares L, Gordon S, Wong SY. 2002. The beta-glucan receptor, dectin-1, is predominantly expressed on the surface of cells of the monocyte/macrophage and neutrophil lineages. J Immunol 169: 3876-3882.
Shao BM, Xu W, Dai H, Tu P, Li Z, Gao XM. 2004. A study on the immune receptors for polysaccharides from the roots of Astragalus membranaceus, a Chinese medicinal herb. Biochem Biophys Res Commun 320: 1103-1111.
Guinazu N, Carrera-Silva EA, Becerra MC, Pellegrini A, Albesa I, Gea S. 2010. Induction of NADPH oxidase activity and reactive oxygen species production by a single Trypanosoma cruzi antigen. Int J Parasitol 40: 1531-1538.
Gelderman KA, Hultqvist M, Olsson LM, Bauer K, Pizzolla A, Olofsson P, Holmdahl R. 2007. Rheumatoid arthritis: the role of reactive oxygen species in disease development and therapeutic strategies. Antioxid Redox Signal 9: 1541-1567.
Hultqvist M, Backlund J, Bauer K, Gelderman KA, Holmdahl R. 2007. Lack of reactive oxygen species breaks T cell tolerance to collagen type II and allows development of arthritis in mice. J Immunol 179: 1431-1437.
Hultqvist M, Olofsson P, Holmberg J, Backstrom BT, Tordsson J, Holmdahl R. 2004. Enhanced autoimmunity, arthritis, and encephalomyelitis in mice with a reduced oxidative burst due to a mutation in the Ncf1 gene. Proc Natl Acad Sci USA 101: 12646-12651.
Lasek W, Feleszko W, Golab J, Stoklosa T, Marczak M, Dabrowska A, Malejczyk M, Jakobisiak M. 1997. Antitumor effects of the combination immunotherapy with interleukin-12 and tumor necrosis factor alpha in mice. Cancer Immunol Immunother 45: 100-108.
Lee JN, Lee DY, Ji IH, Kim GE, Kim HN, Sohn J, Kim S, Kim CW. 2001. Purification of soluble beta-glucan with immune-enhancing activity from the cell wall of yeast. Biosci Biotechnol Biochem 65: 837-841.
Schantz SP, Brown BW, Lira E, Taylor DL, Beddingfield N. 1987. Evidence for the role of natural immunity in the control of metastatic spread of head and neck cancer. Cancer Immunol Immunother 25: 141-148.
Saiki I, Saito S, Fujita C, Ishida H, Iida J, Murata J, Hasegawa A, Azuma I. 1988. Induction of tumoricidal macrophages and production of cytokines by synthetic muramyl dipeptide analogues. Vaccine 6: 238-244.
※ AI-Helper는 부적절한 답변을 할 수 있습니다.