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문제 정의
- MDI로 분화를 유도한 3T3-L1 preadipocyte의 지방세포형성 (adipogenesis)에 구절초가 미치는 영향을 살펴보았다. 그 결과 Fig.
- 구절초가 보유한 지방세포 내 중성지방 제거능(lipolysis activity)을 알아보기 위해 다음과 같이 수행하였다. Confluent 상태의 3T3-L1 지방전구세포를 2일간 배양한 다음 MDI를 첨가한 DMEM 배지로 2일간 배양하고 10 μg/ml이 든 DMEM 배지에 4일간 추가 배양하였다.
- 본 연구에서는 구절초가 보유한 지방 생성 억제능의 작용기전을 알아보기 위하여 구절초 추출물이 adipogenesis에 관여하는 주요 핵심 조절자인 C/EBPα, C/EBPβ, 그리고 PPARγ 의 유전자 및 단백질 발현에 미치는 영향을 분석하였다. 그 결과 MDI 처리에 의해 지방세포 분화가 일어난 대조군에서는 세 인자의 유전자 및 단백질 발현이 유의적으로 증가되었으며 C/EBPα의 경우 최소 농도인 50 μg/ml부터 유전자 및 단백질 발현이 감소되었으며, C/EBPβ의 경우 저농도에서는 농도에 따른 발현의 변화가 큰 차이를 보이지 않다가 고농도로 갈수록 유전자 및 단백질 발현이 크게 저해 되었다.
- 매우 유용한 시험법이다[7]. 본 연구에서는 구절초의 항비만 활성을 세포 실험계에서 분석하기에 앞서 시료가 보유한 lipase 효소 활성 저해능을 다음과 같이 측정하였다. 먼저 1.
- 1). 이러한 결과는 구절초가 lipase inhibitor 로 작용하여 항비만 활성을 보유할 가능성을 시사하였다.
- 이에 본 연구에서는 한방에서 약재로 사용되고 있는 구절초추출물의 항비만 효과를 알아보고 기능성 소재로서의 활용 가능성을 확인해 보고자 하였다.
제안 방법
- 0.5 μM 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX), 1 μM dexamethasone (DEX), 10 μg/ml의 insulin (이하 MDI)을 처리하여 adipogenesis를 유도하고 구절초 추출물에 의한 항비만 활성을 분석하였다[30].
- 12-well tissue culture plate에 well 당 2×105개의 세포를 분주하고 2일 후 10% FBS가 든 배지로 교체하였다. 2일 경과 후 MDI가 든 배지로 교체하면서 시료를 농도 별로 처리하고 2일 간격으로 총 4회 insulin과 시료를 처리하였다. 마지막 시료를 처리하고 2일 경과 후 위상차 현미경을 이용하여 지방세포 분화 정도 및 시료에 의한 분화 억제 정도를 200배 배율로 관찰하여 촬영한 후, 지방세포 분화 억제능 및 TG 생성 저해능을 Oil Red O staining을 통해 분석하였다.
- 6-Well tissue culture plate에 3×105개의 세포를 분주하고 지방 생성 억제능 분석과 동일한 방법으로 시료를 처리한 후유 전자 발현 분석을 위한 RNA를 분리하여 RT-PCR로 분석하였다. 먼저 시료 처리가 완료된 배양 세포의 total RNA를 TRIzol (Invitrogen, CA, USA)을 사용하여 추출한 후 Nano-Vue plus spectrophotometer (GE healthcare, WI, USA)를 이용하여 정량하고 SuperScriptTM First-Strand Synthesis System (Invitrogen)을 이용하여 cDNA를 합성한 후 PCR을 수행하였다.
- Confluent 상태의 3T3-L1 지방전구세포를 2일간 배양한 다음 MDI를 첨가한 DMEM 배지로 2일간 배양하고 10 μg/ml이 든 DMEM 배지에 4일간 추가 배양하였다. 지방세포 분화가 완료된 3T3-L1 cell에 구절초 추출물을 농도별로 48시간 처리 후 중성 지방분해에 의해 배지에 방출된 glycerol 양을 glycerol-3-phos-phate oxidase (GPO)-TRINDER kit (SIGMA, St.
- (Santa Cruz, CA, USA)로부터 구입하여 사용하였다. Membrane 수세 후 이차 항체로 한 시간 동안 반응시키고 chemiluminescence detection system (FluoChem® FC2, AlphaInnotech, USA)을 이용하여 각 단백질의 발현을 분석하였다.
- 구절초 추출물의 지방 생성 억제능의 평가를 위해 먼저 3T3-L1 preadipocyte의 세포 생존율에 미치는 영향을 WST assay를 이용하여 분석하였다. 그 결과 Fig.
- 구절초가 지방세포분화를 억제할 뿐만 아니라 생성된 지방의 제거에도 효과적인지를 판단하기 위해 지방세포 내 중성지방 제거능을 lipolysis activity를 통해 분석하였다. 그 결과 Fig.
- 2%로 나타났다. 또한 구절초의 lipase 활성 억제능 보유 유무를 알아보기 위해 각 추출물의 농도별 처리에 따른 lipase의 활성 변화를 분석하였다. 그 결과 1.
- 2일 경과 후 MDI가 든 배지로 교체하면서 시료를 농도 별로 처리하고 2일 간격으로 총 4회 insulin과 시료를 처리하였다. 마지막 시료를 처리하고 2일 경과 후 위상차 현미경을 이용하여 지방세포 분화 정도 및 시료에 의한 분화 억제 정도를 200배 배율로 관찰하여 촬영한 후, 지방세포 분화 억제능 및 TG 생성 저해능을 Oil Red O staining을 통해 분석하였다. 지방세포 분화 및 시료 처리가 완료된 세포를 1× phosphate buffered saline (PBS)으로 씻어준 다음 10% formalin으로 고정하고 Oil Red O staining solution을 처리한 후 30분간 염색하였다.
- 본 연구에서는 구절초의 항비만 활성을 세포 실험계에서 분석하기에 앞서 시료가 보유한 lipase 효소 활성 저해능을 다음과 같이 측정하였다. 먼저 1.5 ml tube에 0.25 M Tris (pH 7.7), 250 mM CaCl2, 5 mM 4-nitrophenyl dodecanoate (PNPD)로 구성된 효소액과 기질을 넣고 잘 섞어준 후 37℃에서 5분간 예열하고, 0.25 M Tris (pH 7.7) 에녹인 lipase와 시료를 넣어 37℃에서 10분간 반응시킨 후 20% sodium dodecyl sulfate (SDS)를 첨가하여 반응을 종료하였다. 반응액을 4℃, 15,000 rpm에서 20분간 원심분리하여, 분리한 상층액을 96-well tissue culture plate에 분주하고 multiplate reader (Paradigm, Bechman, CA, USA)를 이용하여 412 nm에서 흡광도를 측정한 후, 10분간 반응시킨 시료의 흡광도로부터 0분 반응 시료의 흡광도를 뺀 값을 control 대비 백분율로 나타내었다.
- 먼저 시료 처리가 끝난 배양 세포에서 cell lysate 를 추출하여 Bradford assay로 단백질 농도를 결정한 후 50 μg의 단백질을 10% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)로 전기영동하고 nitrocellulose membrane에 blotting한 후 대상 단백질의 일차 항체와 hybridization하였다. 실험에 사용한 C/EBPα와 C/EBPβ의 일차 항체는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)로부터 구입하였고, PPARγ 및 actin의 일차 항체와 horse radish peroxidase가 부착된 anti-goat, anti-rabbit, anti-mouse 등의 이차 항체는 Santa Cruz Biotechnology Inc.
- 먼저 시료 처리가 완료된 배양 세포의 total RNA를 TRIzol (Invitrogen, CA, USA)을 사용하여 추출한 후 Nano-Vue plus spectrophotometer (GE healthcare, WI, USA)를 이용하여 정량하고 SuperScriptTM First-Strand Synthesis System (Invitrogen)을 이용하여 cDNA를 합성한 후 PCR을 수행하였다. 유전자 발현 분석의 internal control로는 housekeeping gene인 glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) 를 사용하였으며 실험에 사용한 대상 유전자의 primer se-quence는 Table 1에 제시한 바와 같다.
- 상기의 RT-PCR 분석에서와 같은 방법으로 실험을 수행한 후 시료 처리가 끝난 세포에서 단백질을 분리하여 지방 생성 관련 단백질의 발현 변화를 Western blot hybridization으로 분석하였다. 먼저 시료 처리가 끝난 배양 세포에서 cell lysate 를 추출하여 Bradford assay로 단백질 농도를 결정한 후 50 μg의 단백질을 10% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)로 전기영동하고 nitrocellulose membrane에 blotting한 후 대상 단백질의 일차 항체와 hybridization하였다.
- 1×105 cell을 24-well tissue culture plate 에 분주하여 24시간 동안 부착시킨 후 시료를 농도 별로 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 시료 처리 후 WST 시약이 든 배지로 교체하여 한 시간 동안 반응시킨 후 multi-plate reader (Paradigm, Beckman, CA, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정값은 3회 반복 실험의 평균값으로 나타내었으며 독성을 유발하지 않는 농도 범위에서 이후 실험을 수행하였다.
- Confluent 상태의 3T3-L1 지방전구세포를 2일간 배양한 다음 MDI를 첨가한 DMEM 배지로 2일간 배양하고 10 μg/ml이 든 DMEM 배지에 4일간 추가 배양하였다. 지방세포 분화가 완료된 3T3-L1 cell에 구절초 추출물을 농도별로 48시간 처리 후 중성 지방분해에 의해 배지에 방출된 glycerol 양을 glycerol-3-phos-phate oxidase (GPO)-TRINDER kit (SIGMA, St. Louis, MO, USA)를 사용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정값은 3회 반복 실험의 평균값으로 나타내었다.
- 건조한 10 g의 구절초를 칭량하여 분말로 파쇄한 후 시료 부피의 5배의 메탄올을 첨가하여 환류 냉각장치를 이용하여 65℃에서 3회 반복 추출하였다. 추출한 시료는 감압농축(N-1000S-W, EYELA, Japan) 및 동결 건조 (FDU2100, EYELA, Japan)한 후 중량법으로 수율을 계산하고 사용 전까지 4℃에 보관하였다.
- 시료 처리 후 WST 시약이 든 배지로 교체하여 한 시간 동안 반응시킨 후 multi-plate reader (Paradigm, Beckman, CA, USA)를 이용하여 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정값은 3회 반복 실험의 평균값으로 나타내었으며 독성을 유발하지 않는 농도 범위에서 이후 실험을 수행하였다.
- 항비만 활성 분석 수행 전 시료가 세포생존율에 미치는 영향을 확인함과 동시에 세포 독성을 유발하지 않는 시료의 처리 농도를 결정하기 위해 water soluble tetrazolium (WST) assay를 수행하였다. 1×105 cell을 24-well tissue culture plate 에 분주하여 24시간 동안 부착시킨 후 시료를 농도 별로 처리하여 72시간 동안 배양하였다.
대상 데이터
- 먼저 시료 처리가 끝난 배양 세포에서 cell lysate 를 추출하여 Bradford assay로 단백질 농도를 결정한 후 50 μg의 단백질을 10% sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)로 전기영동하고 nitrocellulose membrane에 blotting한 후 대상 단백질의 일차 항체와 hybridization하였다. 실험에 사용한 C/EBPα와 C/EBPβ의 일차 항체는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)로부터 구입하였고, PPARγ 및 actin의 일차 항체와 horse radish peroxidase가 부착된 anti-goat, anti-rabbit, anti-mouse 등의 이차 항체는 Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, USA)로부터 구입하여 사용하였다. Membrane 수세 후 이차 항체로 한 시간 동안 반응시키고 chemiluminescence detection system (FluoChem® FC2, AlphaInnotech, USA)을 이용하여 각 단백질의 발현을 분석하였다.
- 실험에 사용한 구절초는 부산광역시 소재 ㈜대한생약제품에서 구입하여 사용하였다. 건조한 10 g의 구절초를 칭량하여 분말로 파쇄한 후 시료 부피의 5배의 메탄올을 첨가하여 환류 냉각장치를 이용하여 65℃에서 3회 반복 추출하였다.
- 항비만 활성 분석에 사용되는 대표적인 cell model system 인 3T3-L1 preadipocyte를 American Type Culture Collection (ATCC, VA, USA)로부터 구입하여 10% fetal bovine serum (FBS) 및 penicillin/streptomycin이 포함된 DMEM 배지에서 배양하였다. 0.
데이터처리
- 실험의 결과는 평균(mean) ± 표준편차(standard deviation, SD)로 나타내었고, 각 데이터의 통계 분석은 unpaired Stu-dent’s t-test를 통해 p 값이 0.05 미만(p<0.05)인 경우 유의성이 있는 것으로 판단하였다.
성능/효과
- 또한 구절초의 lipase 활성 억제능 보유 유무를 알아보기 위해 각 추출물의 농도별 처리에 따른 lipase의 활성 변화를 분석하였다. 그 결과 1.5 mg/ml 이상의 농도에서 유의적인 활성저해를 나타내어 구절초 추출물이 lipase 활성을 농도의존적으로 억제시키는 것을 확인하였다(Fig. 1). 이러한 결과는 구절초가 lipase inhibitor 로 작용하여 항비만 활성을 보유할 가능성을 시사하였다.
- 이용하여 분석하였다. 그 결과 Fig. 2A에 제시한 바와 같이 0에서 500 μg/ml의 처리 농도 범위에서 세포독성을 유발하지 않아 구절초 추출물이 세포독성을 유발하지 않는 안전성이 높은 소재임을 확인하였다.
- 구절초가 미치는 영향을 살펴보았다. 그 결과 Fig. 2B에 제시된 바와 같이 지방 세포 분화가 농도 의존적으로 억제되었고 Oil Red O staining 결과 염색된 지방의 수가감소됨을 확인할 수 있었다. 지방 생성의 억제 정도를 정량적으로 평가하기 위해 염색된 지방을 추출하여 TG 생성량의 정도를 측정한 결과 50에서 500 μg/ml의 시료 처리 범위에서 농도 의존적으로 감소를 나타내었으며 억제능의 정도는 300, 400, 500 μg/ml의 처리에 의해 각각 35, 61, 68%로 나타났다 (Fig.
- 제거능을 lipolysis activity를 통해 분석하였다. 그 결과 Fig. 4에 제시한 바와 같이 MDI로 분화시킨 지방세포에 구절초추출물을 처리한 결과 세포 내 축적되어 있던 중성지방의 분해를 통해 배지로 방출된 glycerol의 양이 증가되는 것으로 나타났다. 배지를 제거하고 Oil Red O staining을 수행한 후 현미경 관찰 및 남아있는 TG 양을 측정한 결과 방출된 glycerol의 양과 비례적으로 세포 내에 남아있는 TG의 양이 감소되는 것으로 나타나 구절초 추출물이 지방세포 내에 축적되어있는 중성지방을 제거하는 것을 확인하였다.
- 그 결과 MDI 처리에 의해 지방세포 분화가 일어난 대조군에서는 세 인자의 유전자 및 단백질 발현이 유의적으로 증가되었으며 C/EBPα의 경우 최소 농도인 50 μg/ml부터 유전자 및 단백질 발현이 감소되었으며, C/EBPβ의 경우 저농도에서는 농도에 따른 발현의 변화가 큰 차이를 보이지 않다가 고농도로 갈수록 유전자 및 단백질 발현이 크게 저해 되었다. PPARγ의 경우에는 100 μg/ml 이상에서 유전자와 단백질 발현이 감소되었다(Fig.
- 4에 제시한 바와 같이 MDI로 분화시킨 지방세포에 구절초추출물을 처리한 결과 세포 내 축적되어 있던 중성지방의 분해를 통해 배지로 방출된 glycerol의 양이 증가되는 것으로 나타났다. 배지를 제거하고 Oil Red O staining을 수행한 후 현미경 관찰 및 남아있는 TG 양을 측정한 결과 방출된 glycerol의 양과 비례적으로 세포 내에 남아있는 TG의 양이 감소되는 것으로 나타나 구절초 추출물이 지방세포 내에 축적되어있는 중성지방을 제거하는 것을 확인하였다.
- 3). 이러한 결과를 바탕으로 구절초 추출물이 보유한 지방세포분화 억제능이 adipogenesis에 관여하는 핵심 인자의 유전자 및 단백질 발현 저해를 통해 나타나며 특히 C/EBP α, β의 발현 조절을 통해 나타날 가능성을 확인하였다.
- 이러한 결과를 통해 구절초 추출물이 lipase 효소활성 억제능, 지방세포 분화 억제능, 지방세포 내 중성지방 제거 능을 통한 항비만 활성을 보유함을 확인하였다. 이러한 결과는 구절초 추출물의 항비만 활성을 처음으로 밝혀낸 것이며 추후계속적인 연구를 통해 활성 물질의 규명이 필요할 것으로 판단된다.
- 2C). 이러한 결과를 통해 구절초가 지방 생성 억제능을 보유함을 확인하였다.
- 2B에 제시된 바와 같이 지방 세포 분화가 농도 의존적으로 억제되었고 Oil Red O staining 결과 염색된 지방의 수가감소됨을 확인할 수 있었다. 지방 생성의 억제 정도를 정량적으로 평가하기 위해 염색된 지방을 추출하여 TG 생성량의 정도를 측정한 결과 50에서 500 μg/ml의 시료 처리 범위에서 농도 의존적으로 감소를 나타내었으며 억제능의 정도는 300, 400, 500 μg/ml의 처리에 의해 각각 35, 61, 68%로 나타났다 (Fig. 2C). 이러한 결과를 통해 구절초가 지방 생성 억제능을 보유함을 확인하였다.
후속연구
- 항비만 활성을 보유함을 확인하였다. 이러한 결과는 구절초 추출물의 항비만 활성을 처음으로 밝혀낸 것이며 추후계속적인 연구를 통해 활성 물질의 규명이 필요할 것으로 판단된다. 현재까지 알려진 구절초의 주요 성분으로는 sesquiterpene lactones, polyacetylenic compounds, flavonoids 등이 있다[25].
- 이 중 sesquiterpene lactone에 속하는 수 종의 화합물들이 구절초의 주요 활성 성분으로서 항산화[40], 항암[32], 항염증[6] 등의 생리활성을 나타내는 것으로 보고 되고 있다. 한편 sesquiterpene lactone의 하나인 dehydroleucodine의 항비만 활성에 대한 보고[9]가 있으나 구절초에서는 아직 알려진바 없어 구절초의 항비만 활성 보유 물질 규명에 대한 계속적인 연구가 필요한 것으로 판단된다.
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