히솝(Hyssopus officinalis)은 통화식물목 꿀풀과의 여러해살이풀로 방부제, 기침, 거담제 등 일반적으로 방향족 허브와 약용식물로 사용되어왔다. 본 연구에서는 항산화 및 미백소재의 개발을 위해 히솝을 열수와 주정으로 추출하여 각 추출물의 in vitro 상에서의 항산화 효과 및 B16F10 melanoma 세포에서 멜라닌 생성 저해효과를 평가하였다. DPPH와 ABTS assay 시험법을 이용하여 항산화 효과를 측정한 결과, 히솝 추출물의 항산화 활성이 모두 농도 의존적으로 증가하였다. 또한 히솝 추출물은 tyrosianse 활성을 저해시켰으며, B16F10 세포에서 UVB로 증가된 활성산소와 ${\alpha}$-MSH로 유도된 멜라닌 또한 감소시키는 효과를 보였다. 멜라닌 생합성에 관여하는 유전자의 발현에 미치는 영향을 알아보기 위해 RT-PCR을 실시한 결과 히솝 추출물에 의해 MITF, tyrosinase, TRP-2의 발현이 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과에 따라 히솝 추출물은 미백개선을 위한 화장품 소재로서 이용 가능성이 높을 것으로 사료된다.
히솝(Hyssopus officinalis)은 통화식물목 꿀풀과의 여러해살이풀로 방부제, 기침, 거담제 등 일반적으로 방향족 허브와 약용식물로 사용되어왔다. 본 연구에서는 항산화 및 미백소재의 개발을 위해 히솝을 열수와 주정으로 추출하여 각 추출물의 in vitro 상에서의 항산화 효과 및 B16F10 melanoma 세포에서 멜라닌 생성 저해효과를 평가하였다. DPPH와 ABTS assay 시험법을 이용하여 항산화 효과를 측정한 결과, 히솝 추출물의 항산화 활성이 모두 농도 의존적으로 증가하였다. 또한 히솝 추출물은 tyrosianse 활성을 저해시켰으며, B16F10 세포에서 UVB로 증가된 활성산소와 ${\alpha}$-MSH로 유도된 멜라닌 또한 감소시키는 효과를 보였다. 멜라닌 생합성에 관여하는 유전자의 발현에 미치는 영향을 알아보기 위해 RT-PCR을 실시한 결과 히솝 추출물에 의해 MITF, tyrosinase, TRP-2의 발현이 감소되는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과에 따라 히솝 추출물은 미백개선을 위한 화장품 소재로서 이용 가능성이 높을 것으로 사료된다.
Hyssopus officinalis is a herbaceous plant of the genus Hyssopus. Due to its properties as an antiseptic, cough reliever and expectorant, it is commonly used as an aromatic herb and medicinal plant. This study was performed to investigate the anti-oxidative and anti-melanogenic properties of Hyssopu...
Hyssopus officinalis is a herbaceous plant of the genus Hyssopus. Due to its properties as an antiseptic, cough reliever and expectorant, it is commonly used as an aromatic herb and medicinal plant. This study was performed to investigate the anti-oxidative and anti-melanogenic properties of Hyssopus officinalis extracts (HE) using in vitro assays and cell culture systems. As a result, HE showed higher DPPH and ABTS radicals scavenging activity in a dose-dependent manner. Also, HE inhibited the prodution of intracellular ROS and melanin contents in B16F10 melanoma cell as well as tyrosinase activity. We also found that HE inhibit mRNA expression of MITF, tyrosinase and TRP-2 gene. These findings suggest that HE may be beneficial for preventing oxidative damage and melanogenesis of skin.
Hyssopus officinalis is a herbaceous plant of the genus Hyssopus. Due to its properties as an antiseptic, cough reliever and expectorant, it is commonly used as an aromatic herb and medicinal plant. This study was performed to investigate the anti-oxidative and anti-melanogenic properties of Hyssopus officinalis extracts (HE) using in vitro assays and cell culture systems. As a result, HE showed higher DPPH and ABTS radicals scavenging activity in a dose-dependent manner. Also, HE inhibited the prodution of intracellular ROS and melanin contents in B16F10 melanoma cell as well as tyrosinase activity. We also found that HE inhibit mRNA expression of MITF, tyrosinase and TRP-2 gene. These findings suggest that HE may be beneficial for preventing oxidative damage and melanogenesis of skin.
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문제 정의
본 연구에서는 열수와 주정으로 추출한 히솝 추출물을 각각 사용하여 B16F10 melanoma 세포에서 항산화 및 미백효과에 대해 평가하였다. 항산화 효과를 평가하기 위해 적용한 DPPH와 ABTS 시험법의 결과, 히솝 추출물에 의해 농도 의존적으로 라디칼 소거능이 증가 된 것을 확인하였다.
이와 같이 히솝의 다양한 효능이 알려진 바에 비해, 항산화 및 멜라닌 생성 저해에 대한 연구는 알려진 바가 없다. 이에 본 연구에서는 B16F10 melanoma 세포를 사용하여 히솝 추출물의 항산화효과 및 멜라닌 생성 저해 효과와 그 작용기전에 대해 조사하였다.
제안 방법
미백관련 인자인 MITF, tyrosinase, TRP-2의 발현에 미치는 영향을 알아보기 위해 RT-PCR을 실시하였다. Total RNA추출은 B16F10 세포를 모아 D-PBS로 세척한 다음 RNA prep kit (Intron, seongnam-si, Korea)를 이용하였다. cDNA 합성은 2 ∼ 5 µg의 RNA와 oligo dT, 5X buffer, dNTPs, 5X DTT, MMLV (Intron, seongnam-si, Korea)를 이용하여 PCR machine (BIOER, Hangzhou, China)에서 25 ℃ 5 min, 42 ℃ 60 min, 70 ℃ 15 min, 4 ℃로 반응시켰다.
UVB에 의해 증가되는 ROS에 대한 소거능을 확인하기 위해 히솝 추출물을 처리한 B16F10 세포에 UVB 를 25 mJ/cm2로 조사한 후 fluorescence microscopy를 통 해 ROS 소거능을 측정하였다. 측정결과, UVB를 조사 할 경우 조사하지 않은 군에 비해 ROS 생성을 증가시킴을 확인하였으며, 히솝 열수 추출물은 큰 효과를 보이지 않았지만 주정 추출물의 경우 UVB로 유도된 ROS를 농도 의존적으로 감소시켰다(Figure 5).
cDNA 1 ∼ 2 µL에 primer F (A)와 primer R (AS)을 넣고 잘 섞어 원심분리한 후 PCR machine을 사용하여 유전자를 증폭하였다.
건조된 히솝 시료를 blender로 마쇄하여 시료의 10배에 달하는 70% 발효주정 에탄올과 증류수를 각각 첨가하여 주정추출과 열수추출을 진행 하였다. 추출은 4 h 동안 80 ℃에서 고온 중탕으로 이루어졌다.
Louis, USA) 용액을 처리하여 80 ℃에서 1 h 동안 반응시킨 후 multi-plate reader (BIOTEK, Vermont, USA)를 이용하여 475 nm에서 흡광도를 측정하였다. 멜라닌 양은 전체 단백질 양을 측정한 후 일정 단백질 양당 멜라닌 양을 계산하였다.
미백관련 인자인 MITF, tyrosinase, TRP-2의 발현에 미치는 영향을 알아보기 위해 RT-PCR을 실시하였다. Total RNA추출은 B16F10 세포를 모아 D-PBS로 세척한 다음 RNA prep kit (Intron, seongnam-si, Korea)를 이용하였다.
본 실험에서 DCF-DA의 농도는 10 µM로 처리 한 후 37 ℃에 30 min 동안 반응 시킨 후 형광현미경(Olympus, Tokyo, Japan)으로 측정하였다.
희석된 용액 240 µL에 시료 60 µL를 가하여 상온의 암소에서 10 min 동안 방치한 후 흡광도를 측정하였다. 양성 대조군으로는 L-ascorbic acid를 사용하였고, ABTS 라디칼 소거능의 정도는 다음과 같은 계산식에 따라 계산하였다.
cells/well로 분주하고 24 h 배양하였다. 히솝 추출물을 처리하여 24 h 배양한 후 PBS (Lonza, Basel, Swiss)를 넣고 UVB를 25 mJ/cm2 선량으로 조사하였다. 이후 ROS 생성량을 측정하기 위해 2’,7’-dichlorofluorescein diacetate (DCF-DA) 염색 방법을 사용하였다.
히솝 추출물이 멜라닌 합성에 관여하는 유전자의 발현을 조절하는지 확인하기 위해 유전자 증폭기술을 응용한 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)방법으로 mRNA 발현을 분석하였다 [21]. 그 결과, TRP-1의 경우에는 발현양상에 변화가 없었다(data not shown).
히솝 추출물이 멜라닌 합성에 미치는 영향을 확인하기 위해 알부틴과 히솝 추출물을 200 µg/mL의 농도로 처리하였으며, 멜라닌의 생성을 증가시키기 위해 α -MSH를 100 nM씩 처리하였다.
Tyrosinase 측정은 mushroom tyrosinase와 기질인 L-DOPA를 사용하였다. 0.
세포 배양에 필요한 Dulbccos’s modified Eagle medium (DMEM, Lonza, Basel Swiss, USA)에서 구입하였으며, penicillin/streptomycin (GIBCO, California, USA)과 fetal bovine serum (FBS, GIBCO, California, USA)에서 구입하여 사용하였다.
데이터처리
통계적 유의성은 SPSS를 이용한 student’s t-test를 시행하여 p-value를 구하였으며, p < 0.05인 경우 유의성이 있다고 판정하였다.
이론/모형
이후 ROS 생성량을 측정하기 위해 2’,7’-dichlorofluorescein diacetate (DCF-DA) 염색 방법을 사용하였다.
추출물에 대한 세포 독성은 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) assay 방법을 이용해 실시하였다. 96-well plate에 B16F10 세포를 분주해서 37 ℃, 5% CO2 incubator에서 24 h 배양하였다.
히솝 추출물이 B16F10 세포에 미치는 세포독성은 MTT assay 시험법을 이용하여 평가하였다. 그 결과 100 ∼ 400 µg/mL의 모든 농도에서 세포생존율이 90% 이상으로 세포 독성을 보이지 않았다(Figure 1).
성능/효과
UVB에 대해 증가된 ROS에 대한 소거능 역시 히솝 열수 추출물에서는 효과가 미비했지만 주정 추출물의 경우 효과적으로 활성산소를 감소시켰으며, 멜라닌 합성 저해효과 또한 주정 추출물 처리군이 α-MSH를 처리한 양성 대조군에 비해 170% 정도 멜라닌 생성을 감소시킴으로써 알부틴보다 뛰어난 효과를 보였다.
결론적으로 히솝 추출물은 항산화 및 tyrosinase 활성 억제능력을 가지고 있으며, MITF, tyrosinase, TRP-2와 같은 멜라닌 형성에 관여하는 효소들의 유전자 발현을 저해함으로써 멜라닌 생성을 억제하는 것으로 보인다.
그 결과 α-MSH를 처리한 군은 208%로 무첨가군에 비해 멜라닌의 생성이 2배 정도 증가하였고, 히솝 추출물과 알부틴에 의해 멜라닌 생성이 줄어드는 것을 관찰할 수 있었다.
그 결과 100 ∼ 400 µg/mL의 모든 농도에서 세포생존율이 90% 이상으로 세포 독성을 보이지 않았다(Figure 1).
더 나아가 히솝 추출물이 멜라닌 생합성에 관여하는 유전자의 발현에 미치는 영향을 알아보기 위해 RT-PCR을 이용하여 유전자 발현을 관찰하였으며 그 결과, 히솝 추출물은 멜라닌 형성에 관여하는 MITF와 tyrosinase, TRP-2의 발현을 억제하는 것으로 나타났다.
항산화 효과를 평가하기 위해 적용한 DPPH와 ABTS 시험법의 결과, 히솝 추출물에 의해 농도 의존적으로 라디칼 소거능이 증가 된 것을 확인하였다. 또한 히솝 추출물이 tyrosinase를 저해함으로써 멜라닌 생성을 억제하는지 확인하기 위해 적용한 L-DOPA 산화 억제능 측정 결과, 히솝 추출물이 농도 의존적으로 tyrosianse 활성을 저해하는 것으로 나타났으며, 항산화 시험과 마찬가지로 주정 추출물이 열수 추출물에 비해 더 좋은 효과를 보임을 확인하였다.
모든 실험의 결과는 3회 반복하였으며, 평균 ± 표준 편차(mean ± S.D.)로 나타내었다.
실험 결과 히솝 추출물은 농도 의존적으로 tyrosinase의 활성을 저해시켰으며, 특히 주정 추출물 400 µg/mL에서는 85% 이상의 높은 산화 억제능을 나타냈다(Figure 4).
로 조사한 후 fluorescence microscopy를 통 해 ROS 소거능을 측정하였다. 측정결과, UVB를 조사 할 경우 조사하지 않은 군에 비해 ROS 생성을 증가시킴을 확인하였으며, 히솝 열수 추출물은 큰 효과를 보이지 않았지만 주정 추출물의 경우 UVB로 유도된 ROS를 농도 의존적으로 감소시켰다(Figure 5).
특히 히솝 주정 추출물을 처리한 군은 α-MSH 처리군과 비교 하여 170% 정도 멜라닌 합성을 억제함으로써 알부틴보다 저해 효과가 뛰어남을 확인할 수 있었다(Figure 6).
본 연구에서는 열수와 주정으로 추출한 히솝 추출물을 각각 사용하여 B16F10 melanoma 세포에서 항산화 및 미백효과에 대해 평가하였다. 항산화 효과를 평가하기 위해 적용한 DPPH와 ABTS 시험법의 결과, 히솝 추출물에 의해 농도 의존적으로 라디칼 소거능이 증가 된 것을 확인하였다. 또한 히솝 추출물이 tyrosinase를 저해함으로써 멜라닌 생성을 억제하는지 확인하기 위해 적용한 L-DOPA 산화 억제능 측정 결과, 히솝 추출물이 농도 의존적으로 tyrosianse 활성을 저해하는 것으로 나타났으며, 항산화 시험과 마찬가지로 주정 추출물이 열수 추출물에 비해 더 좋은 효과를 보임을 확인하였다.
히솝 추출물을 100 ∼ 400 µg/mL 농도로 처리하여 free radical 소거능을 측정한 결과 농도 의존적으로 항산화 활성이 높아지는 것을 확인할 수 있었으며, 특히 히솝 추출물 200, 400 µg/mL 농도에서는 양성 대조군인 L-ascorbic acid와 유사한 수준의 항산화 활성을 보였다(Figure 2).
히솝 추출물을 50 ∼ 200 µg/mL 농도로 처리하여 ABTS radical 소거능을 확인한 결과 ABTS radical 소거능 또한 DPPH assay와 유사한 패턴으로 농도 의존적으로 증가하였으며, 주정 추출물이 열수 추출물에 비해 높은 소거 활성을 나타내었다(Figure 3).
후속연구
따라서 이러한 결과에 의해 히솝 추출물은 향후 미백개선을 위한 화장품 소재로서 개발될 수 있을 것이라 사료되며, 미백효과에 작용하는 다른 신호 전달 경로 메커니즘에 관한 추가적인 연구가 필요하다고 판단된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
멜라닌 합성에 관여하는 효소와 중요 조절 인자에는 어떤 것들이 있는가?
또한 멜라닌 합성에 관여하는 효소로는 tyrosinase와 tyrosinase관련 단백질인 tyrosinase related protein 1 (TRP-1), tyrosinase related protein 2 (TRP-2)가 알려져 있으며, 멜라닌 합성의 중요한 조절 인자로 알려진 microphthalmia-associated transcription factor (MITF)는 tyrosinase, TRP-1, TRP-2의 전사를 촉진하는 것으로 알 려져 있다[17-22]. 따라서 미백 활성 연구개발에 있어서 MITF 뿐만 아니라 tyrosinase, TRP-1, TRP-2 등과 같은 효소의 활성 억제효과 검증은 유용한 1차 평가방법으로 인정되고 있다[23].
히솝은 무엇인가?
본 연구에서 사용된 히솝(Hysspus officinalis)은 통화 식물목 꿀풀과의 여러해살이풀로, 국내에서는 우슬초라고 명명되기도 한다. 히솝의 매운맛이 있는 말빈 성분은 거담작용에 효과가 있으며, 달인액이나 부순 생잎은 세정약 혹은 습포제로 사용하기도 하며, 히솝 추출물 자체는 바이러스 증식 억제의 기능을 하는 것으로 보고되었다.
천연물을 이용한 미백소재 개발이 필요한 이유는 무엇인가?
따라서 미백 활성 연구개발에 있어서 MITF 뿐만 아니라 tyrosinase, TRP-1, TRP-2 등과 같은 효소의 활성 억제효과 검증은 유용한 1차 평가방법으로 인정되고 있다[23]. 이러한 평가에 적용할 때 tyrosinase 억제제 대조군으로 많이 사용되는 kojic acid, 알부틴, 하이드로퀴논과 같은 많은 색소침착 저해 물질들은 강한 미백효과를 가지고 있지만 피부자극 및 접촉성 피부염 등의 부작용을 일으키는 것으로 밝혀졌다[24,25]. 따라서 천연물을 이용한 안전하고 효과적인 미백소재 개발에 관한 연구가 필요하다.
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