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문제 정의
- 식물의 경우, 통상 그 구성성분과 유용 생리활성은 재배환경, 수확시기는 물론 부위별로 차이가 심하게 나타나는 것[2, 17] 이 일반적임에도 불구하고, 함초의 경우 부위별 연구는 잎줄기, 뿌리의 영양성분 및 미네랄 분석 보고[19]가 있을 뿐 현재까지 전무한 실정이다. 따라서 본 연구에서는 함초를 이용한 고부가가치 기능성 음료개발 연구의 일환으로 성숙한함초의 잎, 줄기, 씨를 대상으로 ethanol 추출물을 조제하고 이들의 유용성분 함량과 항산화 및 항혈전 활성을 평가하였다. 실험에 사용한 함초는 2015년 9월말 전남 신안군에서 재배한 함초를 사용하였으며, 구입직후 잎, 줄기, 씨로 구분하였다(Fig.
- 항응고 활성 평가결과, 씨 추출물에서 우수한 트롬빈 저해, 혈액응고인자 저해가 나타났으며, 모든 추출물에서 혈소판 응집저해활성 및 인간 적혈구 용혈활성은 나타나지 않았다. 본 연구는 함초 잎과 씨를 이용한 항혈전제 개발이 가능함을 제시하고 있다.
가설 설정
- 1)Values are mean±SD (n=3). Means with different letter in each column are significantly different by Duncan’s multiple range test(p<0.
- 3)Values are mean±SD (n = 3). Means with different letter in each column are significantly different by Duncan’s multiple range test(p<0.
제안 방법
- 이는 미세전극에 혈소판이 부착되어 응집됨에 따라 발생하는 전기 저항값의 변화를 측정하는 방법으로, 인간 농축 혈소판(platelet rich plasma: PRP)을 전처리 및 수세한 후 최종 혈소판 농도가 6×108/ml 이 되도록 조정하여 사용하였으며, 응집유도제로 collagen (1 mg/ml)을 사용하였다. 응집반응은 collagen 첨가 후 12분간 측정하였으며 amplitude, slope, area under curve (AUC)를 측정하여 평가하였다[14, 15]. 이때, amplitude (ohm) 는 혈소판에 응집유도제를 첨가하였을 때 일어나는 최대 응집 정도를 나타내며, slope는 응집유도제를 첨가한 직후부터 1분 동안의 응집곡선의 기울기를 나타내며, AUC는 전체적인 혈소판 응집 정도를 표시하는 것으로 전기저항 증가에 따른 slope 곡선의 하강면적을 의미한다.
- )를 가하고 혼합하였다. 이후 15분간 실온에서 방치 후 520 nm에서 흡광도를 측정하여 잔존 nitrite 양을 측정하였다. 환원력 평가를 위해서는 ethanol에 용해한 시료 2.
- Lemgo, Germany)를 이용하였다. 즉, 혈전 생성의 최종단계에서 fibrinogen을 fibrin polymer로 전환시키는 thrombin의 활성을 평가하는 thrombin time (TT), 외인성 응고계(Ⅱ, V, VII 및 X 인자)의 응고 활성을 종합적으로 평가하는 prothrombin time (PT), 내인성 경로에 의한 혈액응고활성을 평가하는 activated partial thromboplastin time (aPTT)을 각각 측정하여 평가하였으며, 응고시간은 3회 이상 반복한 함초 시료 첨가구 실험의 응고시간 평균치를 용매 대조구인 DMSO 의 응고시간 평균치의 비로 나타내었다[14, 15]. 실험 결과는 mean±SD로 나타내었고, 통계적 유의성은 상기와 동일한 방법으로 검정하였다.
- 추출물의 총 폴리페놀, 총 플라보노이드, 총당 및 환원당 함량을 측정하였으며, 총 폴리페놀 함량은 추출 검액 400 µl에 50 µl의 folin-ciocalteau, 100 µl의 Na2CO3 포화용액을 넣고, 실온에서 1시간 방치한 후 725 nm에서 흡광도를 측정하여 분석하였으며, 표준시약으로는 tannic acid를 사용하였다[24]. 총 플라보노이드 함량은 시료를 18시간 methanol로 교반 추출하고, 여과한 추출 검액 400 µl에 90% diethylene glycol 4 ml를 첨가하고 다시 1N NaOH 40 µl를 넣고 37℃에서 1시간 반응 후 420nm에서 흡광도를 측정하여 분석하였으며, 표준시약으로는 rutin을 사용하였다[26]. 총당 정량의 경우에는 phenol sulfuric acid법을, 환원당 정량의 경우에는 DNS 변법을 이용하였다[26].
- 1). 추출물 제조를 위해 이물질을 제거하고 수세한 잎, 줄기, 씨에 각각 10배의 95% ethanol (Daejung Chemicals & Metals Co., Ltd., Korea)을 가한 후 상온에서 24시간, 3 회 반복 추출하였으며, 추출액은 filter paper (Whatsman No. 2)로 거른 후 감압 농축(Eyela Rotary evaporator N- 1000, Tokyo Rikakikai Co., Ltd., Japan)하여 분말로 조제하였다. 이때 함초 잎, 줄기 및 씨의 각각의 추출수율은 6.
- 1%를 나타내었다(Table 1). 추출물의 총 폴리페놀, 총 플라보노이드, 총당 및 환원당 함량을 측정하였으며, 총 폴리페놀 함량은 추출 검액 400 µl에 50 µl의 folin-ciocalteau, 100 µl의 Na2CO3 포화용액을 넣고, 실온에서 1시간 방치한 후 725 nm에서 흡광도를 측정하여 분석하였으며, 표준시약으로는 tannic acid를 사용하였다[24]. 총 플라보노이드 함량은 시료를 18시간 methanol로 교반 추출하고, 여과한 추출 검액 400 µl에 90% diethylene glycol 4 ml를 첨가하고 다시 1N NaOH 40 µl를 넣고 37℃에서 1시간 반응 후 420nm에서 흡광도를 측정하여 분석하였으며, 표준시약으로는 rutin을 사용하였다[26].
- 함초 부위별 추출물의 항산화 활성은 기존에 보고한 방법 [14]과 동일하게 DPPH (1, 1-diphenyl-2-picryl hydrazyl) 음이온 소거능, ABTS [2, 2-azobis(3-ethylbenzothiazoline-6- sulfonate)] 양이온 소거능, nitrite 소거능 및 환원력을 측정하여 평가하였으며, 최종 항산화 활성의 비교는 RC50 (표준조건에서 활성 radical을 50% 제거하는데 소요되는 시료의 양)으로 나타내었다. DPPH 음이온 소거능의 경우, 다양한 농도로 희석한 시료 20 µl에 99.
- 함초 부위별 추출물의 항혈전 활성은 혈액응고 저해 활성과 혈소판 응집저해 활성을 측정하여 평가하였다. 혈액 응고 저해 활성은 기존에 보고[15]한 방법과 동일하게, thrombin (Sigma Co.
- 함초를 이용한 고부가가치 기능성 음료 개발 연구의 일환으로, 성숙한 함초의 잎, 줄기, 씨를 대상으로 ethanol 추출물을 조제하고 이들의 항산화 및 항혈전 활성을 평가하였다. 추출물의 총 폴리페놀 함량은 잎>줄기>씨의 순으로, 총 플라보노이드 함량은 잎>씨=줄기 순으로 나타났다.
- 5 ml를 첨가하여 반응을 종료하고 4, 000 rpm에서 10분간 원심분리하여 상등액을 회수하였다. 회수한 상등액은 증류수로 2배 희석한 후, 신선하게 조제된 0.1% ferric chloride 용액과 5:1 (v/v) 비율로 혼합하고 700nm에서 흡광도를 측정하여 평가하였다. 항산화 활성 평가의 대조구로는 vitamin C (Sigma Co.
대상 데이터
- 따라서 본 연구에서는 함초를 이용한 고부가가치 기능성 음료개발 연구의 일환으로 성숙한함초의 잎, 줄기, 씨를 대상으로 ethanol 추출물을 조제하고 이들의 유용성분 함량과 항산화 및 항혈전 활성을 평가하였다. 실험에 사용한 함초는 2015년 9월말 전남 신안군에서 재배한 함초를 사용하였으며, 구입직후 잎, 줄기, 씨로 구분하였다(Fig. 1). 추출물 제조를 위해 이물질을 제거하고 수세한 잎, 줄기, 씨에 각각 10배의 95% ethanol (Daejung Chemicals & Metals Co.
- 혈액 응고 저해 활성은 기존에 보고[15]한 방법과 동일하게, thrombin (Sigma Co., USA), 표준혈장, PT reagent 및 aPTT reagent (MD Pacific Technology Co., Ltd., Huayuan Industrial Area, China)와 Amelung coagulometer KC-1A (Amelung. Lemgo, Germany)를 이용하였다. 즉, 혈전 생성의 최종단계에서 fibrinogen을 fibrin polymer로 전환시키는 thrombin의 활성을 평가하는 thrombin time (TT), 외인성 응고계(Ⅱ, V, VII 및 X 인자)의 응고 활성을 종합적으로 평가하는 prothrombin time (PT), 내인성 경로에 의한 혈액응고활성을 평가하는 activated partial thromboplastin time (aPTT)을 각각 측정하여 평가하였으며, 응고시간은 3회 이상 반복한 함초 시료 첨가구 실험의 응고시간 평균치를 용매 대조구인 DMSO 의 응고시간 평균치의 비로 나타내었다[14, 15].
데이터처리
- Values are mean±SD (n=3). Means with different letter in each column are significantly different by Duncan’s multiple range test(p<0.05).
- 총당 정량의 경우에는 phenol sulfuric acid법을, 환원당 정량의 경우에는 DNS 변법을 이용하였다[26]. 실험 결과는 SPSS 23.0 버전을 사용하여 mean±SD로 나타내었고, 각 군간의 차이는 ANOVA로 분석하였다. 이후 Duncan 다중비교 검증법으로 통계적 유의성 검정을 조사하였으며, 유의수준은 p<0.
- 즉, 혈전 생성의 최종단계에서 fibrinogen을 fibrin polymer로 전환시키는 thrombin의 활성을 평가하는 thrombin time (TT), 외인성 응고계(Ⅱ, V, VII 및 X 인자)의 응고 활성을 종합적으로 평가하는 prothrombin time (PT), 내인성 경로에 의한 혈액응고활성을 평가하는 activated partial thromboplastin time (aPTT)을 각각 측정하여 평가하였으며, 응고시간은 3회 이상 반복한 함초 시료 첨가구 실험의 응고시간 평균치를 용매 대조구인 DMSO 의 응고시간 평균치의 비로 나타내었다[14, 15]. 실험 결과는 mean±SD로 나타내었고, 통계적 유의성은 상기와 동일한 방법으로 검정하였다. 먼저 활성 대조구로 사용된 아스피린(1.
- 0 버전을 사용하여 mean±SD로 나타내었고, 각 군간의 차이는 ANOVA로 분석하였다. 이후 Duncan 다중비교 검증법으로 통계적 유의성 검정을 조사하였으며, 유의수준은 p<0.05로 하였다. 측정 결과, 총 폴리페놀 함량은 잎>줄기>씨의 순, 총 플라보노이드 함량은 잎>줄기=씨의 순으로 나타났으며, 총당 및 환원당 함량은 잎과 줄기가 씨보다 월등히 높았다.
- 1% ferric chloride 용액과 5:1 (v/v) 비율로 혼합하고 700nm에서 흡광도를 측정하여 평가하였다. 항산화 활성 평가의 대조구로는 vitamin C (Sigma Co., USA)를 사용하였으며, 각각의 측정결과는 3회 반복한 실험의 mean±SD로 나타내었고, 통계적 유의성은 상기와 동일한 방법으로 검정하였다. 그 결과, Table 2에 나타낸 바와 같이 함초 잎 추출물 0.
이론/모형
- 총 플라보노이드 함량은 시료를 18시간 methanol로 교반 추출하고, 여과한 추출 검액 400 µl에 90% diethylene glycol 4 ml를 첨가하고 다시 1N NaOH 40 µl를 넣고 37℃에서 1시간 반응 후 420nm에서 흡광도를 측정하여 분석하였으며, 표준시약으로는 rutin을 사용하였다[26]. 총당 정량의 경우에는 phenol sulfuric acid법을, 환원당 정량의 경우에는 DNS 변법을 이용하였다[26]. 실험 결과는 SPSS 23.
- 따라서 향후 함초의 항응고 활성물질 및 혈소판응집 관련물질의 정제를 통한 항혈전 기작 연구가 필요하다고 판단된다. 함초의 항혈전제로의 실제적 이용성 검토를 위해 인간 적혈구에 대한 용혈활성을 기존에 보고한 방법[15] 으로 평가하였으며, 대조구로 사용된 amphotericin B가 0.05 mg/ml에서 100% 용혈활성을 나타냄에 비해, 함초 부위별 추출물들은 0.5 mg/ml 농도에서도 전혀 용혈활성을 나타내지 않았다(결과 미제시). 본 연구결과는 함초의 부위별 성분과 활성이 상이함을 나타내며, 잎 및 씨 추출물을 이용한 항혈전제 개발이 가능함을 제시하고 있다.
- 혈소판은 1차 지혈 플러그(primary hemostatic plug)를 형성하여 혈전생성을 개시하는 중요한 세포[25]로, 혈액응고효소, 응고인자와 함께 혈전 생성을 촉진시킨다. 혈소판 응집저해 활성은 기존에 보고한 방법[15]과 동일하게, Whole Blood Aggregometer (Chrono-log, USA)를 이용한 impedance법으로 평가하였다. 이는 미세전극에 혈소판이 부착되어 응집됨에 따라 발생하는 전기 저항값의 변화를 측정하는 방법으로, 인간 농축 혈소판(platelet rich plasma: PRP)을 전처리 및 수세한 후 최종 혈소판 농도가 6×108/ml 이 되도록 조정하여 사용하였으며, 응집유도제로 collagen (1 mg/ml)을 사용하였다.
성능/효과
- 1)Radical scavenging activity: The concentrations of samples used for DPPH and ABTS scavenging activity assay, and nitrite scavenging activity assay were 500 µg/ml, 500 µg/ml and 200 µg/ml, respectively. The concentration of vitamin C used for assay was 50 µg/ml.
- , USA)를 사용하였으며, 각각의 측정결과는 3회 반복한 실험의 mean±SD로 나타내었고, 통계적 유의성은 상기와 동일한 방법으로 검정하였다. 그 결과, Table 2에 나타낸 바와 같이 함초 잎 추출물 0.5 mg/ml 농도에서 DPPH 음이온 소거능은 28.6%를 나타내어 잎>씨>줄기 순으로 나타났으며, ABTS 양이온 소거 능은 잎과 씨에서 47.1−47.9%의 소거능을 나타내어 잎= 씨>줄기 순으로 나타났다. 환원력 측정결과, 0.
- 5%를 나타내어 잎> 씨>줄기 순으로 나타났다. 다양한 농도에서의 항산화력을 측정한 후, 이를 기초로 RC50을 계산한 결과, 함초 추출물은 DPPH에 대한 RC50은 854−983 µg/ml, ABTS에 대한 RC50 은 511−612 µg/ml, nitrite에 대한 RC50은 349−648 µg/ml 로 나타났다(Table 2). 이는 vitamin C의 DPPH, ABTS, nitrite에 대한 RC50이 각각 9.
- 실험 결과는 mean±SD로 나타내었고, 통계적 유의성은 상기와 동일한 방법으로 검정하였다. 먼저 활성 대조구로 사용된 아스피린(1.5 mg/ml)의 TT, PT, aPTT는 무첨가구에 비해 1.76, 1.48 및 1.59배 증가된 응고시간을 나타내었다(Fig. 2). 함초잎, 줄기, 씨 추출물(5 mg/ml)의 경우, TT는 각각 1.
- 최종 혈소판 응집 활성은 DMSO를 첨가한 대조구와 함초 부위별 시료를 첨가한 실험 구의 AUC 값의 비를 백분율로 나타내었다. 먼저, 대조 구로 사용된 혈소판 응집저해제인 아스피린은 0.25mg/ml 농도에서 무첨가구에 비해 49.5%의 응집율, 0.5mg/ml 농도에서 27.3%의 응집율을 나타내어 농도의존적인 혈소판 응집저해 활성을 나타내었다(Table 3). 그러나 함초 부위별 추출물들은 0.
- 추출물의 총 폴리페놀 함량은 잎>줄기>씨의 순으로, 총 플라보노이드 함량은 잎>씨=줄기 순으로 나타났다. 총당 및 환원당 함량은 잎과 줄기에서 유사하게 나타났으며, 씨 추출물은 잎 추출물의 1/10 정도의 낮은 총당 및 환원당 함량을 나타내었다. 추출물의 항산화 활성을 RC50로 계산한 결과, DPPH 음이온 소거능, 환원력과 nitrite 소거능은 잎> 씨>줄기, ABTS 양이온 소거능은 잎=씨>줄기 순으로 나타났다.
- 이때, amplitude (ohm) 는 혈소판에 응집유도제를 첨가하였을 때 일어나는 최대 응집 정도를 나타내며, slope는 응집유도제를 첨가한 직후부터 1분 동안의 응집곡선의 기울기를 나타내며, AUC는 전체적인 혈소판 응집 정도를 표시하는 것으로 전기저항 증가에 따른 slope 곡선의 하강면적을 의미한다. 최종 혈소판 응집 활성은 DMSO를 첨가한 대조구와 함초 부위별 시료를 첨가한 실험 구의 AUC 값의 비를 백분율로 나타내었다. 먼저, 대조 구로 사용된 혈소판 응집저해제인 아스피린은 0.
- 평가하였다. 추출물의 총 폴리페놀 함량은 잎>줄기>씨의 순으로, 총 플라보노이드 함량은 잎>씨=줄기 순으로 나타났다. 총당 및 환원당 함량은 잎과 줄기에서 유사하게 나타났으며, 씨 추출물은 잎 추출물의 1/10 정도의 낮은 총당 및 환원당 함량을 나타내었다.
- 총당 및 환원당 함량은 잎과 줄기에서 유사하게 나타났으며, 씨 추출물은 잎 추출물의 1/10 정도의 낮은 총당 및 환원당 함량을 나타내었다. 추출물의 항산화 활성을 RC50로 계산한 결과, DPPH 음이온 소거능, 환원력과 nitrite 소거능은 잎> 씨>줄기, ABTS 양이온 소거능은 잎=씨>줄기 순으로 나타났다. 항응고 활성 평가결과, 씨 추출물에서 우수한 트롬빈 저해, 혈액응고인자 저해가 나타났으며, 모든 추출물에서 혈소판 응집저해활성 및 인간 적혈구 용혈활성은 나타나지 않았다.
- 05로 하였다. 측정 결과, 총 폴리페놀 함량은 잎>줄기>씨의 순, 총 플라보노이드 함량은 잎>줄기=씨의 순으로 나타났으며, 총당 및 환원당 함량은 잎과 줄기가 씨보다 월등히 높았다. 특히 씨 추출물의 경우 잎 추출물의 1/10 정도의 낮은 총당 및 환원당 함량을 나타내었다.
- 추출물의 항산화 활성을 RC50로 계산한 결과, DPPH 음이온 소거능, 환원력과 nitrite 소거능은 잎> 씨>줄기, ABTS 양이온 소거능은 잎=씨>줄기 순으로 나타났다. 항응고 활성 평가결과, 씨 추출물에서 우수한 트롬빈 저해, 혈액응고인자 저해가 나타났으며, 모든 추출물에서 혈소판 응집저해활성 및 인간 적혈구 용혈활성은 나타나지 않았다. 본 연구는 함초 잎과 씨를 이용한 항혈전제 개발이 가능함을 제시하고 있다.
후속연구
- 이전 연구에서 함초 및 효소처리함초 추출물에서 혈액응고인자 저해활성이 보고[9]된 바 있으나, 함초의 트롬빈 및 프로트롬빈 저해활성은 아직까지 알려진 바 없다. 따라서 상기 결과는 함초가 항혈전활성의 기능성 식품소재로 유용함을 제시하고 있으며, 현재까지 acetylcholine esterase 저해와 nitrite 소거활성만이 보고 [18]된 함초 씨를 이용한 항혈전제로의 개발 가능성을 제시하고 있다.
- 25 mg/ml 농도에서 혈소판 응집저해 활성이 나타나지 않았으며, 줄기 및 씨 추출물은 오히려 혈소판 응집을 촉진하였다. 따라서 향후 함초의 항응고 활성물질 및 혈소판응집 관련물질의 정제를 통한 항혈전 기작 연구가 필요하다고 판단된다. 함초의 항혈전제로의 실제적 이용성 검토를 위해 인간 적혈구에 대한 용혈활성을 기존에 보고한 방법[15] 으로 평가하였으며, 대조구로 사용된 amphotericin B가 0.
- 5 mg/ml 농도에서도 전혀 용혈활성을 나타내지 않았다(결과 미제시). 본 연구결과는 함초의 부위별 성분과 활성이 상이함을 나타내며, 잎 및 씨 추출물을 이용한 항혈전제 개발이 가능함을 제시하고 있다.
- 다양한 농도에서의 항산화력을 측정한 후, 이를 기초로 RC50을 계산한 결과, 함초 추출물은 DPPH에 대한 RC50은 854−983 µg/ml, ABTS에 대한 RC50 은 511−612 µg/ml, nitrite에 대한 RC50은 349−648 µg/ml 로 나타났다(Table 2). 이는 vitamin C의 DPPH, ABTS, nitrite에 대한 RC50이 각각 9.8, 5.3, 18.0 µg/ml임을 고려하면 상대적으로 미약한 활성으로 판단되며, 추후 함초 잎 및 씨로부터 항산화 활성분획물 및 활성물질의 분리가 필요하다고 판단된다.
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