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문제 정의
- 본 연구에서는 국내에 자생하는 천연자원으로부터 활성 성분 연구의 일환으로 부채마(D. nipponica) 근경의 추출물에서 추가적인 성분연구를 진행 하였다. 50% EtOH 추출한 부채마 근경 추출액을 n-hexane, chloroform, ethyl acetate, n-butanol을 이용해 순차적인 용매분획을 시행하였고, 이 중 chloroform 층과 ethyl acetate 층으로부터 column chromatography법을 이용하여 12종의 스테로이드 사포닌 화합물을 분리하였다.
제안 방법
- 1H NMR spectrum에서 δ 5.29(1H, overlap, H-1′′), 4.94(1H, overlap, H-1′)에 존재하는 2 개의 anomeric proton을 확인하였다.
- TLC는 Merck precoated silica gel F254 plates를 이용하였으며, RP TLC로는 RP-C18 F254s plates가 이용되었다. 254 nm와 365 nm 파장에서의 UV light를 이용하여 1차적으로 확인하고 anisaldehyde-sulfuric acid를 이용하여 발색 확인하였다.
- nipponica) 근경의 추출물에서 추가적인 성분연구를 진행 하였다. 50% EtOH 추출한 부채마 근경 추출액을 n-hexane, chloroform, ethyl acetate, n-butanol을 이용해 순차적인 용매분획을 시행하였고, 이 중 chloroform 층과 ethyl acetate 층으로부터 column chromatography법을 이용하여 12종의 스테로이드 사포닌 화합물을 분리하였다. 분리된 화합물의 구조는 1H, 13C NMR 및 MS를 이용하여 결정하였으며 기존에 보고된 문헌과 비교하여 확인하였다(Fig.
- EtOH 농축액을 증류수 800 ml에 녹인 후에 n-hexane, chloroform, ethyl acetate, n-butanol을 이용해 순차적인 용매분획을 시행하여 각각 1 g, 35 g, 10 g, 200 g을 얻었다. Chloroform 분획 9.5 g을 silica gel column[230-400mesh, 360 g; chloroform/MeOH(60:1~1:1)]을 수행하여 7개의 소분획(C1-C7)으로 나누었다. 소분획 C2(5.
- NO생성과 세포생존율 측정 – LPS(lipopolysaccharide) 활성화 된 BV-2세포에서 NO 생성 억제를 측정하기 위해서 여러 농도 별로 처리한 실험군과 대조군을 LPS(100 ng/mL)와 함께 24시간 세포 배양 후 griess 시약(0.1% N-1-naphthylethylenediamine dihydrochloride, 1% sulfanilamide in 5% phosphoric acid)을 이용하여 NO수치가 측정되었다.
- 기기 및 시약 – 1H NMR과 13C NMR spectra는 Varian UNITY INOVA 500 NMR spectrometer를 이용하여 측정하였다.
- 또한, 화합물 1-12의 항염증 활성을 알아보기 위하여 LPSstressed murine microglia BV-2 cell에서 생성된 NO 수치를 측정하였고, 양성 대조군으로 L-NMMA가 사용되었다(TableII). 화합물 4는 L-NMMA(IC50 24.
- 부채마 근경의 EtOH 추출물로부터 column chromatography법을 통해 총 12종의 steroidal saponin을 분리하였고, 이들의 구조는 spectroscopy법과 기존에 보고된 논문과 비교하여 각각 동정하였다. 화합물 2, 7, 11은 부채마에서 처음으로 분리된 것으로 확인하였다.
- 부채마(D. nipponica) 근경의 50% EtOH 추출물로부터 극성 별 용매 분획을 통해서 얻은 분획물을 각종 column chromatography법을 이용하여 총 12종의 화합물을 분리하였다. 분리된 화합물들은 NMR(1H, 13C NMR)과 FAB-MS 데이터를 기존 문헌과 비교하여 구조를 동정 하여 diosgenin(3β, 25R)-spirost-5-en-3-ol (1),9) 25R-dracaenoside E (2),10)dioscin (3),11) gracillin (4),12) prosapogenin B (5),13) 25(R)-dracaenoside G (6),10) diosgenin 3-O-β-D-glucopyranosyl (1→3)-β-D-glucopyranoside (7),14) ophipogonin C′ (8),13) 7-oxodioscin (9),15) protodioscin (10),16) hypoglaucin F (11),16)및 protoneogracillin (12)17)으로 확인하였다.
- 분리된 화합물들은 NMR(1H, 13C NMR)과 FAB-MS 데이터를 기존 문헌과 비교하여 구조를 동정 하여 diosgenin(3β, 25R)-spirost-5-en-3-ol (1),9) 25R-dracaenoside E (2),10)dioscin (3),11) gracillin (4),12) prosapogenin B (5),13) 25(R)-dracaenoside G (6),10) diosgenin 3-O-β-D-glucopyranosyl (1→3)-β-D-glucopyranoside (7),14) ophipogonin C′ (8),13) 7-oxodioscin (9),15) protodioscin (10),16) hypoglaucin F (11),16)및 protoneogracillin (12)17)으로 확인하였다.
- 50% EtOH 추출한 부채마 근경 추출액을 n-hexane, chloroform, ethyl acetate, n-butanol을 이용해 순차적인 용매분획을 시행하였고, 이 중 chloroform 층과 ethyl acetate 층으로부터 column chromatography법을 이용하여 12종의 스테로이드 사포닌 화합물을 분리하였다. 분리된 화합물의 구조는 1H, 13C NMR 및 MS를 이용하여 결정하였으며 기존에 보고된 문헌과 비교하여 확인하였다(Fig. 1). 이들 화합물(1-12)은 C6 glioma cell에서 nerve growth factor(NGF)의 분비 유도를 통한 신경보호 활성과 murine microglia BV-2 cell에서 nitric oxide(NO) 생성 억제를 통한 항염증 활성을 측정하였다.
- 신경세포보호 효과 – C6 glioma 세포를 24-well plate에 1×105cells/well 농도로 분주한 뒤 24시간 동안 배양하였고, 다양한 농도의 시료와 함께 24시간 동안 serum-freeDMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)에 처리하였다.
- 분리된 화합물들은 NMR(1H, 13C NMR)과 FAB-MS 데이터를 기존 문헌과 비교하여 구조를 동정 하여 diosgenin(3β, 25R)-spirost-5-en-3-ol (1),9) 25R-dracaenoside E (2),10)dioscin (3),11) gracillin (4),12) prosapogenin B (5),13) 25(R)-dracaenoside G (6),10) diosgenin 3-O-β-D-glucopyranosyl (1→3)-β-D-glucopyranoside (7),14) ophipogonin C′ (8),13) 7-oxodioscin (9),15) protodioscin (10),16) hypoglaucin F (11),16)및 protoneogracillin (12)17)으로 확인하였다. 이들 중 화합물 2, 7, 11은 부채마(D. nipponica)에서 처음 분리된 화합물로 구조 동정에 응용 된 기기분석 자료를 하기에 간단히 토의하였다(Fig. 1).
- 1). 이들 화합물(1-12)은 C6 glioma cell에서 nerve growth factor(NGF)의 분비 유도를 통한 신경보호 활성과 murine microglia BV-2 cell에서 nitric oxide(NO) 생성 억제를 통한 항염증 활성을 측정하였다.
대상 데이터
- Column chromatography에 이용된 충진제는 silica gel 60(Merk Co., 70 – 230 mesh), RP-C18silica gel(YMC GEL ODS-A, 12nm, S-75 μm)과 sephadexLH-20(Pharmacia Co.)가 이용되었다.
- C NMR spectra는 Varian UNITY INOVA 500 NMR spectrometer를 이용하여 측정하였다. FAB mass spectra는 JEOL JMS700 mass spectrometer를 이용하였다. Semi-preparative HPLC는 Gilson 306 pump와 Shodex refractive index detector를 함께 이용하였고, column으로는 Encosil® RP-C18 10μ column(250 × 10 mm)을 이용하였다.
- )가 이용되었다. TLC는 Merck precoated silica gel F254 plates를 이용하였으며, RP TLC로는 RP-C18 F254s plates가 이용되었다. 254 nm와 365 nm 파장에서의 UV light를 이용하여 1차적으로 확인하고 anisaldehyde-sulfuric acid를 이용하여 발색 확인하였다.
- 실험재료 – 연구에 사용된 부채마는 2009년 1월 경동시장(서울)에서 구입하여 사용하였다.
이론/모형
- 1% N-1-naphthylethylenediamine dihydrochloride, 1% sulfanilamide in 5% phosphoric acid)을 이용하여 NO수치가 측정되었다. 96-well plate에 세포 배양 상등액과 griess 시약을 1:1 혼합하여 넣고 10분간 반응시킨 후 microplate reader(Emax,Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 570nm에서 흡광도를 측정하였고, 세포 생존율은 MTT assay를 통해 측정되었다.8)
- cells/well 농도로 분주한 뒤 24시간 동안 배양하였고, 다양한 농도의 시료와 함께 24시간 동안 serum-freeDMEM(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)에 처리하였다. NGF 수치는 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay) 키트를 통해 측정 되었고, MTT(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2, 5-diphenyl-tetrazolium bromide) assay를 통해 세포 생존율을 측정하였다. 양성 대조군으로는 6-Shogaol이 사용되었고, NGF 분비율과 세포 생존율은 각각 151.
성능/효과
- p>부채마(Dioscorea nipponica)는 마과(Dioscoreaceae)에 속하며, 한국, 일본, 중국에 널리 분포하는 다년생 덩굴식물이다.1) 근경은 옆으로 뻗고 딱딱하며 원주형의 형태를 띠고 전통적으로 류머티즘, 천식, 기관지염의 치료에 처방 되어왔다.2,3) 부채마에서 연구된 식물화학적 성분으로는 steroidal saponin,4) phenanthrene5) 및 phenol성 화합물6) 등이 있으며 기존에 보고 된 약리학적 연구에서 부채마의 추출물이 신경영양학적 활성을 가지는 것으로 보고된 바 있다.
- 그 결과, 화합물 7 과 10은 6-shogaol(151.88±1.32%)과 비교했을 때 C6 cell에 대한 강한 세포독성 없이 유효한 NGF 분비 유도 효과를 나타내었다(7; 178.82±4.75, 10; 165.42±1.84%).
- 그리고 105.0(C-1′′′′), 102.8(C-1′′′), 102.0(C-1′′), 100.2(C-1′)의 4 개의 anomeric carbon과 20개의 peak를 통해 4개의 당이 존재하는 것을 예상할 수 있었고, rhamnose의 특징적인 methyl carbon(δ 18.6, 18.4)을 관찰함으로써 2개의 rhamnose의 존재를 확인하였다.
- 그리고 화합물 1, 4-6, 12는 일반적인 NGF 분비 유도 효과를 나타내는 것으로 확인하였다(1; 126.12±0.22, 4; 108.36±3.04, 5; 106.69±1.95,6; 109.32±0.31, 12; 107.69±1.37%).
- 또한 화합물 3은 더 강한 NO 생성 저해 수치를 나타내었지만(IC50 7.7 μM), BV-2 cell의 세포 생존율을 17.8±2.7%로 감소시키는 것으로 확인되었다.
- 양성 대조군으로는 6-Shogaol이 사용되었고, NGF 분비율과 세포 생존율은 각각 151.88%±1.32% 와 104.49±4.19%로 확인되었다.
- 이상의 spectroscopic data를 기존 문헌과 비교하여 화합물 7의 구조가 diosgenin 3-O-β-D-glucopyranosyl (1→3)-β-D-glucopyranoside임을 확인할 수 있었다.
- 3으로 downfield shift하는 것을 확인하여 glucose의 C-4′과 rhamnose C-1′′의 연결을 예상할 수 있었다. 이상의 기기분석 자료와 기존에 보고된 문헌과의 비교를 통해 화합물 2의 구조를 25R-dracaenoside E로 확인하였다.10)
- 화합물 2, 7, 11은 부채마에서 처음으로 분리된 것으로 확인하였다. 화합물 1-12에 대한 신경보호 및 항염증 활성을 측정하였으며, 화합물 7과 10은 강한 NGF 분비 유도 효과를 나타내었고 화합물 4는 현저한 NO 생성억제 활성을 나타내었다.
- 화합물 11은 무색의 gum 형태로 FAB-MS spectrum에서 molecular ion peak가 m/z 1065 [M+H]+로 관찰되었고, 화합물 7 과의 1H, 13C NMR data 비교를 통해 spirostanesteroid의 F-ring이 개환 된 형태임을 확인하였다. 1H NMR spectrum에서 δ 5.
- 화합물 1과의 13C NMR data 비교에서 C-3이 δ 71.7에서 δ78.1로 downfield shift하는 것을 통해 glucose의 C-1′이 모 핵의 C-3에 연결되어 있음을 예상했고, 화합물 8과의 비교를 통해 glucose의 C-4′의 peak가 δ 72.8에서 δ 78.3으로 downfield shift하는 것을 확인하여 glucose의 C-4′과 rhamnose C-1′′의 연결을 예상할 수 있었다.
- 화합물 2는 무색의 gum 형태의 물질로서 FAB-MS spectrum에서 molecular ion peak가 m/z 739[M+H]+로 관찰되었으며, 1H NMR spectrum에서 δ 5.34(1H, brd, H-6)의olefinic proton과 δ 1.12(3H, d, J=6.5 Hz, H-21), 1.02(3H, s, H-18), 0.94(3H, s, H-19), 0.61(3H, d, J=5.0 Hz, H-27)에서 4 개의 methyl proton을 포함한 특징적인 peak들을 화합물 1과 비교했을 때 spirostane계 steroid의 골격임을 확인할 수 있었다.
- 화합물 7의 성상은 흰색 분말로 FAB-MS spectrum에서 m/z 739[M+H]+ 값을 통해 분자량을 확인하였고, 화합물 2와의 1H, 13C NMR data 비교에서 rhamnose moiety의 차이를 제외하고 유사한 구조임을 예상할 수 있었다. 1H NMR spectrum에서 δ 5.
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