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문제 정의
- 따라서, 바이러스의 존재 유무를 확인하는 것은 환자의 스크리닝에 도움을 주며, 최근에 세포학적 검사와 함께 보조적인 검사법으로 사용되고 있다. 본 연구는 16종의 고위험군 바이러스와 HPV 16, HPV 18 유전형을 검출 할 수 있는 HPV ViroCheck의 발암 유전자의 분석 성능을 확립하기 위한 목적으로 수행되었다. 먼저, 16종의 고위험군 HPV의 발암유전자 E6/E7 유전형의 검출한계를 확인하기 위하여, 분석적 민감도를 수행하였다.
제안 방법
- VGX-3100 was administered through intramuscular injection followed by electroporation to 18 female patients who had been previously treated for CIN2/3 lesions [27]. Each patient received three rounds of vaccination, which was well tolerated with no observed dose-limiting toxicities. As therapeutic vaccines using HPV E6/E7 were developed, the complementary diagnosis for follow-up of vaccine efficacy will be needed.
- Now, we developed E6/E7 based tests and commercialized. In this study, we evaluated the newly developed HPV E6/E7 tests, which detects 16 HR HPVs as well as major types of HPV 16 and HPV 18. HPV plasmid DNA and HPV infected cells were examined by analytical sensitivity, specificity, and reproducibility test.
- HPV ViroCheck assay kit (Optipharm M&D, Osong, Korea) was performed using CFX-96 (Bio-Rad, Hercules, USA) real-time PCR systems for thermocycling and fluorescence detection, according to the manufacturers’ instructions. The PCR primers and the corresponding TaqManⓇ probes were designed for three different sets of HPVs, in each case targeting their common sequence (Group I: HPV genotypes 16, 31, 33, 35, 52, and 58; Group II: HPV genotypes 18, 39, 45, 51, and 68; and Group III: HPV genotypes 53, 56, 59, 66, and 69). Real-time PCR amplification for HPV E6/E7 gene was performed in a total volume of 20 μL containing 10 μL 2 × Thunderbird probe qPCR mix (Toyobo, Osaka, Japan), 5 L primer and TaqMan probe mixture, 2 μL template cDNA, and 3 μL DWfor each well.
- To find out how many cells from cervical cancer can be detected, the LoD of cervical cancer cell lines, which were HPV 16 infected SiHa, HPV 18 infected HeLa, and HPV negative C33A, was performed in replicates of 10 times, resulting in a total of 20 replicates, over 3 days by RT-qPCR. The mean of GAPDH in 20 replicates was 38.
- 먼저, 16종의 고위험군 HPV의 발암유전자 E6/E7 유전형의 검출한계를 확인하기 위하여, 분석적 민감도를 수행하였다. 그리고, 관련된 미생물 및 바이러스에서의 교차반응 및 정확도를 비교하여 평가하였다. 고위험군 HPV 유전자형의 민감도는 Clone DNA를 이용 하였을 때, 최대 1카피에서 100 카피까지 검출이 가능하였고, SiHa 세포와 Hela 세포의 경우 최소 10 세포까지 검출이 가능하였다.
- 본 연구는 16종의 고위험군 바이러스와 HPV 16, HPV 18 유전형을 검출 할 수 있는 HPV ViroCheck의 발암 유전자의 분석 성능을 확립하기 위한 목적으로 수행되었다. 먼저, 16종의 고위험군 HPV의 발암유전자 E6/E7 유전형의 검출한계를 확인하기 위하여, 분석적 민감도를 수행하였다. 그리고, 관련된 미생물 및 바이러스에서의 교차반응 및 정확도를 비교하여 평가하였다.
대상 데이터
- The 1 copy of LoD in HPV 16 and HPV 31 was shown. 10 copies of LoD were HPV 33, HPV 52, HPV 35, HPV 53, HPV 59, HPV 66, and HPV 69. 100 copies of LoD were HPV 18, HPV 39, HPV 45, HPV 51, HPV 56, HPV 58, and HPV 68.
- 10 copies of LoD were HPV 33, HPV 52, HPV 35, HPV 53, HPV 59, HPV 66, and HPV 69. 100 copies of LoD were HPV 18, HPV 39, HPV 45, HPV 51, HPV 56, HPV 58, and HPV 68. All of cloned 16 HPV types plasmid DNAs were detected below 100 copies/test and CV was below 3% (Table 1).
- For precision test, a total number of measurements per sample was 144 (12 days×2 runs/day×2 replicates×3 lots). HPV 16 clone DNA for FAM dye of Group I, HPV 33 clone DNA for HEX dye of Group I, HPV 18 clone DNA for FAM of Group II, HPV 39 clone DNA for HEX of Group II, HPV 53 clone DNA for HEX with 500 copies, 100 copies, and negative were used. The total within-run CV ranged from 0% to 0.
- SiHa, HeLa, and C33A cells were purchased from American Type Culture Collection (ATTC, Manassas, USA) and Korean Cell Line Bank (Seoul, Korea). SiHa cells and HeLa were cultured in Dulbecco’s MEM (DMEM) Eagle, with 10% fetal bovine serum (FBS), and standard antibiotics.
- 인간유두종 바이러스 (HPV)는 자궁경부암의 주요 원인이며, 자궁경부암의 주요 원인 바이러스는 16종의 고위험군 유전형 HPV 16, HPV 18, HPV31, HPV 33, HPV 35, HPV 39, HPV 45, HPV 51, HPV 52, HPV 53, HPV 56, HPV 58, HPV 59, HPV 66, HPV 68, HPV 69 이다. 특히, HPV 16형과 HPV 18형이 HPV 양성 암환자의 70%에서 발견된다.
성능/효과
- 100 copies of LoD were HPV 18, HPV 39, HPV 45, HPV 51, HPV 56, HPV 58, and HPV 68. All of cloned 16 HPV types plasmid DNAs were detected below 100 copies/test and CV was below 3% (Table 1).
- 2 for HPV 56. The total between-day CV ranged from 1.3% to 2.8% for HPV 16, 1.9% to 2.1% for HPV 33, 2.0% to 2.5% for HPV 18, 2.1% for HPV 39, 1.9% to 2.9% for HPV 53, and 2.5% to 3.2% for HPV 56. The total lot to lot CV ranged from 0.
- 2% for HPV 56. The total lot to lot CV ranged from 0.0% to 0.2% for HPV 16, 0.4% to 0.6% for HPV 33, 0.3% for HPV 18, 0.5% to 1.0% for HPV 39, 0.1% to 0.4% for HPV 53, and 0.5% to 0.6% for HPV 56 (Table 4).
- HPV 16 clone DNA for FAM dye of Group I, HPV 33 clone DNA for HEX dye of Group I, HPV 18 clone DNA for FAM of Group II, HPV 39 clone DNA for HEX of Group II, HPV 53 clone DNA for HEX with 500 copies, 100 copies, and negative were used. The total within-run CV ranged from 0% to 0.2% for HPV 16, 0.2% to 0.3% for HPV 33, 0.1% to 0.4% for HPV 18, 0.1% to 0.3% for HPV 39, 0.4% to 0.5% for HPV 53, and 0.2 to 0.3 for HPV 56. The total between-run CV ranged from 0% to 0.
- 그리고, 관련된 미생물 및 바이러스에서의 교차반응 및 정확도를 비교하여 평가하였다. 고위험군 HPV 유전자형의 민감도는 Clone DNA를 이용 하였을 때, 최대 1카피에서 100 카피까지 검출이 가능하였고, SiHa 세포와 Hela 세포의 경우 최소 10 세포까지 검출이 가능하였다. 자궁경부 관련 미생물 및 바이러스에서 HPV 유전형에 대한 교차 반응은 나타내지 않았다.
- 자궁경부 관련 미생물 및 바이러스에서 HPV 유전형에 대한 교차 반응은 나타내지 않았다. 또한, 측정법 내 변동계수 및 측정법 간 변동계수 실험 결과 변동계수가 5% 이하로 정확도가 높았다. 위의 분석 성능자료는 HPV ViroCheck의 유전자형 검사의 식품의약품 안전처의 체외진단용 의료기기 허가를 위한 자료로 사용 될 것이며, 향후, HPV 16종의 발암유전자 검출과 HPV 16, HPV 18 유전형 검출 연구에 도움이 될 것이다.
후속연구
- 또한, 측정법 내 변동계수 및 측정법 간 변동계수 실험 결과 변동계수가 5% 이하로 정확도가 높았다. 위의 분석 성능자료는 HPV ViroCheck의 유전자형 검사의 식품의약품 안전처의 체외진단용 의료기기 허가를 위한 자료로 사용 될 것이며, 향후, HPV 16종의 발암유전자 검출과 HPV 16, HPV 18 유전형 검출 연구에 도움이 될 것이다.
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