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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 정상세포 및 종양세포주에 대한 직접적인 세포독성을 나타내지 않는다고 판단, 브로콜리 유래 열수추출물 BCHW 및 조다당 BCCP 시료에 초점을 두어 차후 면역활성 실험을 진행하기로 하였다.
- 앞선 결과를 종합해 보면, 브로콜리 유래 3종의 추출물 중 면역활성에 주로 관여하는 것은 조다당 BCCP라고 결론지었다. 따라서 본 연구진은 브로콜리 유래 열수추출물 BCHW와조다당 BCCP에 대한 일반 분석 및 구성당 분석을 진행하여 총당 함량과 이에 따른 구성당 비율을 정량분석하여 면역활성에 공헌하는 물질을 확인하고자 하였다.
- 따라서 본 연구진은 브로콜리로부터 새로운 활성물질을 찾고자 여러 추출법으로 분리된 추출물을 이용하여 이들이 갖고 있는 대식세포 활성 및 장관면역 활성을 in vitro 상에서 검토함으로써, 브로콜리 유래 면역증강 기능성 소재로써의활용가능성에 대한 기초자료를 제공하고자 하였다.
- 제주산 브로콜리로부터 에탄올과 물을 이용, 3종의 추출물을 분리하여 새로운 면역활성 물질을 확인하고자 하였다. 브로콜리 가식부만을 얻어 8배의 에탄올을 가하여 추출한 에탄올 추출물 BCEE, 이 때 남은 잔사(AIR)에서 열수추출하여 제조한 단순 열수추출물 BCHW, 열수추출 후 4배의 에탄올을 넣고 얻은 침전물을 다시 소량의 물에 용해한 후, 투석 및 동결건조를 거쳐 조다당 BCCP를 얻었다.
제안 방법
- BALB/c(6주령, female) mouse를 경추탈골법으로 치사시킨 후 무균상태에서 비장(spleen)을 적출하여 PBS 상에서 마쇄(100 mesh)한 후 여과(200 mesh)하여 비장세포를 획득하였다. 0.
- BALB/c(6주령, female) mouse의 복강에 5% thioglycollate(TG)(Sigma Aldrich)를 1 mL 주입하고, 96시간 동안 유도된 macrophage를 회수한 후 DMEM 배지로 4~5회 세척하고, 세포수를 2×105 cells/well로 조정하여 24시간 배양하고, macrophage에 의해 분비된 세포 배양액을 원심분리(900 rpm, 4℃, 5 min)하여 배양액에서 생산된 cytokine 분비능을 확인하였다.
- C3H/HeN mouse 소장 외벽에 존재하는 Peyer's patch를 회수, 여과, 세척하고 2×105 cells/well로 세포농도를 조정한 후 96-well microplate(flat-bottom type)에 180 μL씩 분주하고, 시료를 다양한 농도로 희석하여 20 μL씩 분주하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 5일간 배양한 후, 상등액을 이용하여 골수세포 증식능을 측정하였다.
- GC의 분석은 SP-2380 capillary column(0.2 μm film, 0.25 mm×30 m, Supelco, Bellefonte, PA, USA)이 장착된 GC ACME6100(Young-Lin Co. Ltd., Anyang, Korea)을 이용하였으며, 표준온도조건[60℃(1 min), 60⟶220℃(30℃/min), 220℃(12 min),220⟶250℃(8℃/min), 250℃(15 min)]에서 분석을 실시하였다.
- PBS에 10배 희석하여 well 당 200 μL씩 가한 후 37℃, 5% CO2 배양기에서 3~6시간 반응시키고, 450 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 이를 수치화하기 위해 PBS를 사용한 대조군과 골수세포의증식도를 비교하여 정량화하였다.
- 골수세포 증식은 Hong 등(1998)의 방법을 실험실 여건에 맞게 일부 변형하여 측정하였다. C3H/HeN mouse 소장 외벽에 존재하는 Peyer's patch를 회수, 여과, 세척하고 2×105 cells/well로 세포농도를 조정한 후 96-well microplate(flat-bottom type)에 180 μL씩 분주하고, 시료를 다양한 농도로 희석하여 20 μL씩 분주하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 5일간 배양한 후, 상등액을 이용하여 골수세포 증식능을 측정하였다.
- 골수세포는 동일종 mouse의 대퇴부 뼈 속으로 PBS를 넣은 주사기를 주입하여 골수세포를 시험관에 받은 후, 200 mesh로 여과한 후 2.5×104 cells/well로 세포농도를 조정하고 96-wellmicroplate(flat-bottom type)에 100 μL씩 분주하였다.
- 구성당 분석은 다당 시료를 2 M trifluoroacetic acid(TFA)로 121℃에서 1.5시간 산가수분해하고, ring을 개환한 후 acetylation을 거쳐 각각 alditol acetate 유도체(Jones & Albersheim1972)로 전환시킨 후, acetone에 희석하여 GC로 분석하였다.
- , Anyang, Korea)을 이용하였으며, 표준온도조건[60℃(1 min), 60⟶220℃(30℃/min), 220℃(12 min),220⟶250℃(8℃/min), 250℃(15 min)]에서 분석을 실시하였다. 구성당의 mole%는 peak의 면적비, flame ionization detector(FID)에 대한 반응계수 및 각 구성당의 alditol acetate 유도체의 분자량으로부터 계산하였다.
- 다음으로 위에서 얻은 골수세포 상등액과 DMEM medium을 각각 50μL씩 첨가하고, 37℃, 5% CO2 배양기에서 6일간 배양하였다.
- 배양 종료 후 원심분리(900 rpm, 4℃, 5 min)하여 세포배양액을 회수하고, 증식능(lymphocyte proliferation)을 측정하기 위해 10배 희석한 EZ-cytox(Daeil lab service)를 well 당 200 μL씩 가한 후 37℃, 5% CO2 배양기에서 3~6시간 반응시키고 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 분리된 비장세포 100 μL와 다양한 농도로 희석된 시료 100 μL를 96-well microplate(flat-bottom type)에분주한 후 37℃, 5% CO2 배양기에서 72시간 배양하였다.
- 브로콜리 유래 에탄올 추출물 BCEE, 단순 열수추출물 BCHW와 조다당 BCCP의 정제도를 확인하기 위해 시료(10 mg/mL)를 조제하여 여과한 후, 50 mM ammonium formate buffer(pH 5.5)로 평형화된 Superdex 75 GL 10/300 column(GE Healthcare Life Science, Uppsala, Sweden)이 장착된 high performance liquid chromatography(HPLC)(Agilent Technologies Co., Santa Clara, CA, USA)를 이용하여 분석하였다.
- 브로콜리 유래 에탄올 추출물 BCEE, 열수추출물 BCHW 및 조다당 BCCP 시료에 대한 mouse 복강 유래 macrophage의 cytokine 생산을 in vitro에서 측정하였다. 그 결과, Fig.
- 브로콜리 유래 에탄올 추출물 BCEE, 열수추출물 BCHW 및 조다당 BCCP에 대한 종양세포주 및 일반세포에 대한 세포독성을 확인하고자 human 유래 SW-620과 HT-29 colon cancer cells, A549와 NCI-H460 lung cancer cells를 이용하였고, mouse 유래 Colon26-M3.1 colon cancer cells와 B16-BL6lung cancer cells, 그리고 정상세포인 마우스 복강 유래 대식세포를 이용하였다. 종양세포주의 경우, 각각 1×105 cells/well의 농도로 계수한 후 96-well microplate(flat-bottom type)에100 μL씩 분주하고, 37℃, 5% CO2 배양기에서 2일간 배양하였고, mouse 복강 유래 macrophages의 경우, 2×105 cells/well의 농도로 계수한 후 96-well microplate(flat-bottom type)에100 μL씩 분주하였다.
- 브로콜리로부터 두 가지 방법을 이용하여 면역활성 시료를 분리하였다. 먼저 브로콜리 가식부만을 얻어 거칠게 마쇄한 후 deionized water(DIW)를 2배 첨가하여 1시간 동안 정치하였다.
- 브르콜리 유래 열수추출물 BCHW와 조다당 BCCP 시료의 활성화 여부를 측정하기 위해 항보체 활성을 측정하였다. 양성대조군으로는 운지버섯(Coriolus versicolor) 유래 면역활성 다당체인 PSK를 사용하였으며(Tsukagoshi 1984), 음성대조군으로는 증류수를 이용하였다.
- 세포현탁액은 stainless steel mesh(200 mesh)로 여과한 후, FBS-DMEM(with 10% FBS, Welgene Inc.)으로 세척하고 1×106 cells/well로 세포농도를 조정한 후, 96-well microplate(flat-bottom type)에 100 μL씩 분주하고, 다양한 농도로 희석된 시료를 100 μL 씩 첨가하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 72시간 동안 배양하였다.
- 시료에 대한 직접적인 세포독성 여부를 측정하기 위해 브로콜리 유래 에탄올 추출물 BCEE, 열수추출물 BCHW 및 조다당 BCCP 시료를 이용, human 유래 종양세포주인 대장암 유래의 SW-620 세포주와 HT-29 세포주, 폐암 유래의 A549 세포주와 NCI-H460 세포주, mouse 유래 종양세포는 대장암 유래의 Colon26-M3.1 세포주와 흑색종 유래의 B16-BL6 총 6종의 종양세포주, 그리고 정상세포주인 mouse 복강 유래 macrophage에 대한 세포독성을 측정하였다(Table 1). 그 결과, 브로콜리 유래 열수추출물 BCHW 및 조다당 BCCP 시료의 경우, 6종의 종양세포주 및 정상세포주에서 어떠한 독성도 나타내지 않은 반면, 에탄올 추출물 BCEE에서는 SW-620,HT-29, A549, NCI-H460 및 B16-BL6 세포주에 대해 약간의 성장억제능을 보여주었다.
- 시료의 세포독성 측정은 상등액을 제거한 뒤, PBS에 10배 희석한 EZ-cytox(Daeil lab service)를 well 당 200 μL씩 가한 후 37℃, 5% CO2 배양기에서 30~90분간 반응시키고 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
- 시료의 화학적 특성을 확인하기 위해 중성당 함량은 phenolsulfuric acid법(Dubois 등 1956)(standard: galactose)으로, 산성당 함량은 m-hydroxybiphenyl법(Blumenkrantz & Asboe-Hansen 1973)(standard: galacturonic acid)으로, TBA-positive material의 함량은 thiobarbituric acid법(Karkhanis 등 1978)(standard: 2-keto-3-deoxy-D-manno-octulosonic acid(KDO)으로 단백질 함량은 Bradford법(Bradford 1972)(standard: bovine serum albumin(BSA))을 실험실 여건에 맞게 변형하여 사용하였다.
- 이를 동결건조하여 에탄올 추출물(Broccoli ethanol extract; BCEE)을 얻었다. 에탄올 상등액을 회수하고, 남은 잔사(Alcohol insoluble residues; AIR)에 10배의 DIW를 첨가한 후, 전체 부피의 절반이 되는 시점까지 100℃에서 열수추출을 진행하였다. 그 후, 원심분리(6,500 rpm, 30 min,4℃)하여 상등액을 회수한 후, 일부는 동결건조하여 단순 열수추출물(Broccoli hot water extract: BCHW)을 얻었다.
- 이후, 배양상등액을 회수하여 Peyer's patch cells로부터 생성되는 대표적 cytokine GM-CSF(BD biosciences Co., Ltd., SanDiego, CA, USA)를 ELISA kit를 사용하여 제조사의 지침에 따라 측정하였다.
- 장관면역 활성도는 시료와 Peyer’s patch 세포와의 반응 후회수한 상등액을 골수세포와 반응시켜 골수세포가 증식되는 정도를 EZ-cytox(Daeil lab service)로 측정하였다.
- 종양세포주의 경우, 각각 1×105 cells/well의 농도로 계수한 후 96-well microplate(flat-bottom type)에100 μL씩 분주하고, 37℃, 5% CO2 배양기에서 2일간 배양하였고, mouse 복강 유래 macrophages의 경우, 2×105 cells/well의 농도로 계수한 후 96-well microplate(flat-bottom type)에100 μL씩 분주하였다.
- 나머지 상등액에 전체부피의 4배 EtOH을 첨가하여 24 h 방치하고, 원심분리(6,500 rpm, 30 min, 4℃)하여 침전물을 얻었다. 침전물은 소량의 DIW에 재용해한 다음 투석 및 동결건조하여 조다당 시료(Broccoli crude polysaccharide: BCCP)를 얻었다(Fig. 1).
대상 데이터
- BALB/c(6주령, female)를 새론바이오(Gyeonggi, Korea)에서 구입하여 일주일간 순응기간을 거친 후 실험에 사용하였다. Mouse는 사육조에 5마리씩 넣어 온도 23±3℃, 습도 55~70% 및 12시간 간격의 light-dark cycle이 유지되는 공간에서 물과 사료는 자유 급식 형태로 공급하였다.
- C3H/HeN(6주령, female) mouse 소장 외벽에 존재하는 Peyer'spatch를 회수한 후, stainless steel mesh(100 mesh)를 이용하여 조직을 파쇄하여 Peyer's patch로부터 세포를 얻었다.
- Macrophage cytokine 측정 실험에 사용된 Dulbecco Modified Eagle's Medium(DMEM),fetal bovine serum(FBS), penicillin/streptomycin은 Welgene(Daegu,Korea)사에서 구입하였으며, 활성 측정 시 양성대조군으로 사용된 lipopolysaccharide from E. coli O127:B8(LPS)은 SigmaAldrich(St. Louis, MO, USA)사의 제품을 사용하였다.
- 또한, 실험에 사용된 종양세포주는 Korea Cell Line Bank(KCLB)로부터 구입하여 사용하였다. 그 외 본 실험에서 사용된 모든 시약은 시판 1급 이상의 분석용 제품을 구입하여 사용하였다.
- 한편, 항 보체 활성에서 사용된 양의 감작적혈구(IgM-hemolysis sensitized sheep erythrocyte, EA cell)는 일본의 Biotest(Tokyo, Japan)사제품을 사용하였으며, polysaccharide K(PSK) from Coriolusversicolor는 한국 광동제약(Seoul, Korea)에서 시판하는 코포랑®을 사용하였다. 또한, 실험에 사용된 종양세포주는 Korea Cell Line Bank(KCLB)로부터 구입하여 사용하였다. 그 외 본 실험에서 사용된 모든 시약은 시판 1급 이상의 분석용 제품을 구입하여 사용하였다.
- 본 실험에서 사용된 브로콜리는 2014년 제주도에서 재배된 것으로 가식부 부분만을 사용하여 실험을 진행하였다. 세포독성 실험에 사용된 EZ-cytox는 Daeil lab service(Seoul,Korea)사에서 구입하여 사용하였다.
- 본 실험에서 사용된 브로콜리는 2014년 제주도에서 재배된 것으로 가식부 부분만을 사용하여 실험을 진행하였다. 세포독성 실험에 사용된 EZ-cytox는 Daeil lab service(Seoul,Korea)사에서 구입하여 사용하였다. Macrophage cytokine 측정 실험에 사용된 Dulbecco Modified Eagle's Medium(DMEM),fetal bovine serum(FBS), penicillin/streptomycin은 Welgene(Daegu,Korea)사에서 구입하였으며, 활성 측정 시 양성대조군으로 사용된 lipopolysaccharide from E.
- 브르콜리 유래 열수추출물 BCHW와 조다당 BCCP 시료의 활성화 여부를 측정하기 위해 항보체 활성을 측정하였다. 양성대조군으로는 운지버섯(Coriolus versicolor) 유래 면역활성 다당체인 PSK를 사용하였으며(Tsukagoshi 1984), 음성대조군으로는 증류수를 이용하였다. 음성대조군의 활성화 정도를 ITCH50 0%로 하여 열수추출물 BCHW와 조다당 BCCP 시료의 활성화능을 각각 확인한 결과(Fig.
- 한편, 항 보체 활성에서 사용된 양의 감작적혈구(IgM-hemolysis sensitized sheep erythrocyte, EA cell)는 일본의 Biotest(Tokyo, Japan)사제품을 사용하였으며, polysaccharide K(PSK) from Coriolusversicolor는 한국 광동제약(Seoul, Korea)에서 시판하는 코포랑®을 사용하였다.
데이터처리
- 2. Means with different superscript letters (a~c) indicate significant differences at p<0.05 by Duncan's multiple range test.
- Means with different superscript letters (a~d) indicate significant differences at p<0.05 by Duncan's multiple range test.
- Means with different superscript letters (a~f) indicate significant differ- ences at p<0.05 by Duncan's multiple range test.
- Means with different superscript letters (a~f) indicate significant differences at p<0.05 by Duncan's multiple range test.
- 모든 실험결과는 SPSS 20.0(SPSS Inc, IL, USA)을 사용하여 통계 처리하였으며, 평균값±표준편차(mean±S.D.)로 나타내었다.
- 시료간 및 처리 농도간 유의성은 two-way ANOVA 실시한 다음 Duncan’s mutiple range test로 사후 검정을 실시하여 p<0.05 수준에서 유의성을 검증하였다.
이론/모형
- Macrophage에 의해 유도, 분비된 배양 상등액 중의 cytokines(IL-6, IL-12 및 TNF-α) 함량은 enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) kit(BD Bio-sciences and eBiosciences, San Diego,CA, USA)를 제조사의 지침에 따라 측정하였다.
- 항보체 활성(anti-complementary activity)은 Mayer법(Kabat& Mayer 1971)을 이용하여 다양한 농도의 시료로 보체를 활성화 시킨 후, 잔존하는 보체에 의한 적혈구 용혈활성에 근거를 둔 complement fixation test로 측정하였다.
성능/효과
- B 및 T림프구를 통하여 적응 면역을 담당하는 2차 림프조직인 비장(spleen)에서 얻은 세포를 이용하여 macrophage에 의한 cytokine 생산능을 높게 보여주었던 브로콜리 유래 열수 추출물 BCHW와 조다당 BCCP 시료를 첨가하여 그 증식 정도를 확인한 결과, 모든 시료에서 유효한 증식 활성은 나타내지 않았다(Fig. 3).
- 그 결과, Fig. 2에서 보는 바와 같이 먼저 에탄올 추출물 BCEE의 경우에는 1,000μg/mL의 고농도에서도 IL-6, IL-12 및 TNF-α의 생산능에 전혀 영향을 주지 않았으며, 열수추출물 BCHW에서는 1,000 μg/mL의 고농도에서만 IL-6와 TNF-α의 생산능을 positive control인 lipopolysaccharide(LPS) 대비 각각 20%와 80% 정도로 보여주었다.
- 1 세포주와 흑색종 유래의 B16-BL6 총 6종의 종양세포주, 그리고 정상세포주인 mouse 복강 유래 macrophage에 대한 세포독성을 측정하였다(Table 1). 그 결과, 브로콜리 유래 열수추출물 BCHW 및 조다당 BCCP 시료의 경우, 6종의 종양세포주 및 정상세포주에서 어떠한 독성도 나타내지 않은 반면, 에탄올 추출물 BCEE에서는 SW-620,HT-29, A549, NCI-H460 및 B16-BL6 세포주에 대해 약간의 성장억제능을 보여주었다.
- 브로콜리 유래 단순 열수추출물 BCHW 및 조다당 BCCP는 정상세포주 및 종양 세포주에 대한 직접적인 세포독성을 나타내지 않았으며, 대식세포 자극에 대한 cytokine 생산능을 측정한 결과, IL-6,IL-12 및 TNF-α 모두 브로콜리 유래 조다당 BCCP이 에탄올 추출물 BCEE과 단순 열수추출물 BCHW보다 더 우수한 cytokine 분비능을 보여주었다. 그러나 비장세포의 증식능을 확인한 결과, 단순 열수추출물 BCHW 및 조다당 BCCP 시료 모두 증식능을 나타내지 않았다.
- 이상의 결과로부터 브로콜리로부터 분리한 조다당BCCP가 대식세포의 기능과 장관면역계를 증진시킬 수 있는 가능성을 제시하였다. 따라서 브로콜리 유래 단순 열수추출물 BCHW와 조다당 BCCP에 대한 화학적 특성을 분석한 결과, 단순 열수추출물 BCHW의 경우, 중성당과 산성당을 포함한 총당이 64.4% 비율로 존재하였으며, 조다당 BCCP는 93.1%의 다당으로 구성되어 있었다. 따라서 브로콜리의 높은 면역활성은 주로 다당이 관여하는 것으로 최종 확인되었다.
- 따라서 브로콜리 유래 조다당 BCCP가 Peyer’s patch cell의 면역세포를 자극한 후 골수세포 증식에 관여하는 GM-CSF와 같은 cytokine을 분비하여 전신면역에 크게 공헌할 것이라고 결론지었다.
- 따라서 브로콜리 유래 조다당 BCCP가 에탄올 추출물BCEE와 열수추출물 BCHW보다 NK cell 활성화 및 면역세포 활성화와 같은 생체반응을 일으켜 면역활성을 유도하는데 더 우수하다고 확인되었다.
- 1%의 다당으로 구성되어 있었다. 따라서 브로콜리의 높은 면역활성은 주로 다당이 관여하는 것으로 최종 확인되었다.
- 또한, 장관 내 분포되어 있는 Peyer’s patch를 경유하여 장관면역에 공헌하는지에 대한 여부를 확인한 결과, 브로콜리 유래 조다당 BCCP에서 NC 대비 유의적으로 GM-CSF와 같은 관련 cytokine의 분비 유도가 확인되었으며, 골수세포의 증식능을 확인하였다.
- 또한, 조다당 BCCP의 구성당 분석을 정량화한 결과, arabinose 503.9 μg, galactose 289.6 μg 및 rhamnose 110.9μg으로 구성되어 있었으며, mannose와 xylose가 미량 함유되어 있었다.
- 먼저 브로콜리 유래 단순 열수추출물 BCHW에 대한 화학적 조성을 확인한 결과(Table 2), 중성당 33.7%와 산성당 30.7%로 구성되어 있었으나, 이 외에 미지의 물질도 31.4%를 차지하고 있었다. 반면, 조다당 BCCP의 경우에는 중성당 42.
- 반면, 조다당 BCCP의 경우에는 8 μg/mL의 저농도부터 우수한 IL-6와 TNF-α의 생산능을 보여주었으며, IL-12의 경우에는 40 μg/mL의 농도에서 가장 우수한 생산능을 나타냈고, 고농도로 갈수록 감소하는 경향을 나타내었다.
- 6),에탄올 추출물 BCEE의 경우, 저분자 물질만 검출되었으며, 단순 열수 추출물 BCHW는 고분자와 저분자가 혼재되어 있었다. 반면, 조다당 BCCP의 경우에는 고분자가 좌우대칭으로단일피크가 검출된 것으로 보아, 조다당 BCCP에는 분자량이 큰 다당 물질이 주로 존재할 것이라 생각되어 고분자 다당이 브로콜리의 면역활성에 공헌할 것이라 재차 확인시켜 주었다.
- 4%를 차지하고 있었다. 반면, 조다당 BCCP의 경우에는 중성당 42.6%, 산성당 50.5%로 구성되어 조다당 BCCP에는 다당이 시료 전체의 90% 이상을 차지하고 있다는 것을 확인할 수 있었다. 이를 바탕으로 단순 열수추출물 BCHW와 조다당 BCCP의 구성당에 대한 정량분석을 진행한 결과, Table 2에서 보는 바와 같이 단순 열수추출물의 경우, 전체 1g 기준 arabinose 250.
- 브로콜리 유래 단순 열수추출물 BCHW 및 조다당 BCCP는 정상세포주 및 종양 세포주에 대한 직접적인 세포독성을 나타내지 않았으며, 대식세포 자극에 대한 cytokine 생산능을 측정한 결과, IL-6,IL-12 및 TNF-α 모두 브로콜리 유래 조다당 BCCP이 에탄올 추출물 BCEE과 단순 열수추출물 BCHW보다 더 우수한 cytokine 분비능을 보여주었다.
- 브로콜리 유래 에탄올 추출물 BCEE, 단순 열수추출물 BCHW와 조다당 BCCP에 대한 HPLC 정제도를 분석한 결과(Fig. 6),에탄올 추출물 BCEE의 경우, 저분자 물질만 검출되었으며, 단순 열수 추출물 BCHW는 고분자와 저분자가 혼재되어 있었다. 반면, 조다당 BCCP의 경우에는 고분자가 좌우대칭으로단일피크가 검출된 것으로 보아, 조다당 BCCP에는 분자량이 큰 다당 물질이 주로 존재할 것이라 생각되어 고분자 다당이 브로콜리의 면역활성에 공헌할 것이라 재차 확인시켜 주었다.
- 브로콜리 유래 열수 추출물 BCHW와 조다당 BCCP를 Peyer’s patch cell에 처리하고, 이들이 생산한 GM-CSF의 함량을 ELISA로 측정, 열수추출물 BCHW의 경우, 모든 농도에서 GM-CSF의 생산에 어떠한 영향도 미치지 않았으나, 조다당 BCCP의 경우에는 40 μ g/mL 이상 농도에서 유의적인 수준으로 약간 높은 GM-CSF생산능을 보여주었다.
- 앞선 결과를 종합해 보면, 브로콜리 유래 3종의 추출물 중 면역활성에 주로 관여하는 것은 조다당 BCCP라고 결론지었다. 따라서 본 연구진은 브로콜리 유래 열수추출물 BCHW와조다당 BCCP에 대한 일반 분석 및 구성당 분석을 진행하여 총당 함량과 이에 따른 구성당 비율을 정량분석하여 면역활성에 공헌하는 물질을 확인하고자 하였다.
- 위 결과를 바탕으로, 브로콜리 유래 열수추출물 BCHW와조다당 BCCP의 Peyer’s patch를 경유한 골수세포 증식활성을 검토한 결과, 열수추출물 BCHW에서는 골수세포 증식능을 나타내지 않은 반면, 조다당 BCCP는 무첨가군에 비해 40 μg/mL 이상의 농도에서 약간의 골수세포 증식활성을 보여줌으로써 전신순환 후 면역활성에 공헌할 것이라고 확인되었다(Fig.
- 음성대조군의 활성화 정도를 ITCH50 0%로 하여 열수추출물 BCHW와 조다당 BCCP 시료의 활성화능을 각각 확인한 결과(Fig. 5), 1,000 μg/mL의 고농도에서 음성대조군 대비 각각 12.6%와 15.5%의 항보체 활성을 나타내었으며, 조다당 BCCP가 열수추출물 BCHW보다 유의적으로 더 우수한 항보체 활성을 나타내었다.
- 이 결과를 바탕으로 단순 열수추출물 BCHW보다 조다당 BCCP에 다량의 단당들이 더 높은 비율로 함유되어있는 것으로 보아, 아마 브로콜리의 면역활성은 주로 고분자 다당이 공헌할 것이라 최종 결론지었다.
- 반면, 조다당 BCCP의 경우에는 8 μg/mL의 저농도부터 우수한 IL-6와 TNF-α의 생산능을 보여주었으며, IL-12의 경우에는 40 μg/mL의 농도에서 가장 우수한 생산능을 나타냈고, 고농도로 갈수록 감소하는 경향을 나타내었다. 이는 브로콜리 유래 에탄올 추출물 BCEE와 열수추출물 BCHW보다 조다당 BCCP가 더 우수한 cytokine 생산능을 나타내었다.
- 이를 바탕으로 단순 열수추출물 BCHW와 조다당 BCCP의 구성당에 대한 정량분석을 진행한 결과, Table 2에서 보는 바와 같이 단순 열수추출물의 경우, 전체 1g 기준 arabinose 250.1 μg, glucose 166.7 μg 및 galactose 147.1 μg이 다량 함유되어 있었으며, 소량의 rhamnose, mannose와 xylose가 함유되어 있었다.
- 항보체 활성에서도 브로콜리 유래 조다당 BCCP가 단순 열수추출물 BCHW보다 높은 활성을 나타내었다. 이상의 결과로부터 브로콜리로부터 분리한 조다당BCCP가 대식세포의 기능과 장관면역계를 증진시킬 수 있는 가능성을 제시하였다. 따라서 브로콜리 유래 단순 열수추출물 BCHW와 조다당 BCCP에 대한 화학적 특성을 분석한 결과, 단순 열수추출물 BCHW의 경우, 중성당과 산성당을 포함한 총당이 64.
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