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문제 정의
- 그러나 아직까지 뽕잎에 노루궁뎅이 버섯 균사체로 발효시킨 추출물의 생리활성은 보고된 바 없다. 따라서 본 연구에서는 뽕잎 천연물배지에 노루궁뎅이 버섯균사체를 배양시켜 제조한 발효물이 항산화 기능이 있는 지를 확인하고자 하였다. 이와 같은 연구는 노루궁뎅이 버섯균사체 발효물을 이용한 기능성 식품 소재 개발 및 산업화에 도움을 줄 것으로 생각된다.
제안 방법
- ABTS radical 소거활성을 Brand-Williams 등[21]의 방법을 변형하여 측정하였다. 7 mMABTS와 2.
- H2O2에 의한 세포사멸에 뽕잎 발효물이 어떤 영향을 미치는 지를 관찰하였다. H2O2를 처리하기 2시간 전에 뽕잎 발효물을 농도별로 처리하고 H2O2를 2 mM/mL로 처리하여 배양한 결과 H2O2를 처리한 세포의 생존율은 54.
- HSA 단백질에 peroxyl radical을 처리하여 산화적 변형을 유도하고 뽕잎 발효물이 단백질의 변형을 보호하는 지를 알아보았다. HSA 단백질과 50 mM AAPH를 처리하면 HSA 단백질의 펩티드 결합이 파괴되면서 단백질 띠가 거의 사라졌다(Fig.
- 5배수의 물을 첨가하여 3시간 침지시켜준 후 121℃에서 2시간 동안 고압에서 멸균하였다. 멸균시킨 뽕잎을 냉각시킨 후 10% 노루궁뎅이 버섯균사체를 접종하여 25℃에서 60일간 배양기 (multi room incubator, Vision Scientific, Gyeonggi-do, Korea)에 배양하고 60℃에서 2일간 건조시켜 뽕잎 발효물을 제조 하였다. 이와 같은 발효물의 열수 추출물 제조를 위해 뽕잎 발효물 (MA-HE)에 20배의 증류수를 첨가하고 homogenizer (Ultraturrax T-50, Janke &Kunkel GmbH & CO.
- 뽕잎 발효물(MA-HE)이 DNA의 산화적 손상을 억제하는 지를 알아보았다. AAPH는 지질과산화의 initiator로 용액 상에서 산소 radical 중에 하나인 peroxyl radical을 생성하는 화학물질로 잘 알려져 있다[30].
- 세포내 활성산소 생성에 뽕잎 발효물이 미치는 영향을 관찰하였다. H2O2를 처리하지 않은 세포에서는 활성산소 생성 시 발생하는 형광이 나타나지 않았으나 H2O2를 처리한 세포에서는 형광 정도가 선명하게 나타났다.
대상 데이터
- 본 실험에 사용한 뽕잎 (Morus alba; MA)은 2014년 4월에 강원도 정선군에서 채취한 것을 사용하였으며, 균주로 사용한 노루궁뎅이 버섯(Hericium erinaceum)균사체는 충북농업 기술원(Chungbuk, Korea)으로부터 분양받아 potato dextrose agar (PDA, Difco, Detroit, MI, USA)사면배지에서 25℃에서 10일간 배양한 후 4℃에 보존한 노루궁뎅이 버섯균사체를 사용하였다. 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH), phosphate buffer saline (PBS), human serum albumin (HSA), hydrogen peroxide (H2O2), dimethyl sulfoxide (DMSO), Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT), 2`,7`-dichlorofluorescein diacetate (DCF-DA), 등은 Sigma Aldrich (St.
데이터처리
- 실험결과에 대한 통계분석은 SPSS 통계프로그램(Statistical Package for the Social Science, Ver. 12.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 분석하였으며, 모든 실험값은 3회 이상 반복 실시한 결과를 평균 ±표준편차(standard deviation, SD)로 나타내었다. 각 군 간의 측청치 비교는 one-way analysis of variance(ANOVA) test를 실시한 후 95%(P<0.
- , Chicago, IL, USA)을 이용하여 분석하였으며, 모든 실험값은 3회 이상 반복 실시한 결과를 평균 ±표준편차(standard deviation, SD)로 나타내었다. 각 군 간의 측청치 비교는 one-way analysis of variance(ANOVA) test를 실시한 후 95%(P<0.05)의 유의수준에서 Duncan's multiple range test를 이용하여 각 구간의 유의적 차이를 검증하였다.
이론/모형
- DNA의 산화적 손상]에 대한 보호 작용을 확인하기 위해[22]의 방법을 이용하였다. DNA 손상은 peroxyl radical로 유도하였고 용액상에서 peroxyl radical을 생성하기 위해 AAPH를 사용하였다.
- 뽕잎 발효물의 항산화 활성 평가는 DPPH와 ABTS를 이용하여 측정하였다. DPPH radical 소거활성의 경우 양성대조군으로 사용된 ascorbic acid 50 μg/mL 농도에서 79.
성능/효과
- 1. 뽕잎 발효물은 DPPH radical과 ABTS radical 소거활성을 나타냈으며, 발효물의 농도가 증가함에 따라 활성이 유의하게(p<0.01) 증가하였다.
- 2. 뽕잎 발효물은 peroxyl radical에 의한 DNA의 산화적 손상과 HSA의 산화적 변형을 억제하였다.
- 3. 뽕잎 발효물은 H2O2에 의한 세포사멸을 억제하여 세포생존율의 유의한 증가를 보였으며, 세포내의 ROS 생성 억제도 현저히 감소시켰다.
- 뽕잎 발효물의 항산화 활성 평가는 DPPH와 ABTS를 이용하여 측정하였다. DPPH radical 소거활성의 경우 양성대조군으로 사용된 ascorbic acid 50 μg/mL 농도에서 79.52%의 DPPHradical 소거활성을 보였으며 뽕잎 발효물 250μg/mL 농도와 500 μg/mL 농도에서 각각 26.53%, 63% 활성을 나타냈다(Fig. 1).
- 에 의한 세포사멸에 뽕잎 발효물이 어떤 영향을 미치는 지를 관찰하였다. H2O2를 처리하기 2시간 전에 뽕잎 발효물을 농도별로 처리하고 H2O2를 2 mM/mL로 처리하여 배양한 결과 H2O2를 처리한 세포의 생존율은 54.16%로 정상 세포보다 45.25% 감소하였으나 발효물을 100 μg/mL을 처리한 농도에서는 생존율이 55.75%로 세포 보호효과가 있는 것으로 확인되었다(Fig. 5).
- 반면 발효물을 농도별로 처리했을 때는 HSA단백질 띠의 밀도가 증가하였다. HSA 단백질 띠를 밀도 측정기로 측정한 결과 500 μg/mL농도에서 뽕잎 발효물을 처리한 단백질 띠의 밀도가 AAPH만을 처리한 군에 비해 38.30% 이상 보호 되는 것을 확인 할 수 있었다(Fig. 4B).
- 이와 같은 현상은 돌연변이나 노화, 암 등과 같은 질병의 원인이 되고 있다[34,35]. 따라서 뽕잎 발효물은 DNA의 산화적 손상을 보호함으로서 노화 및 질병 예방에 도움이 될 것으로 생각된다.
- 또한 산화된 HSA의 수준은 hemodialysis 환자들의 신장기능 장애와 밀접한 연관성이 있다는 사실이 보고되었다[42]. 따라서 뽕잎 발효물은 세포내의 산화적 손상으로부터 단백질을 보호함으로써 단백질 변형으로 인한 여러 비정상 적인 생리현상을 억제할 것으로 생각된다.
- 본 연구에서는 뽕잎을 천연물배지로 하여 노루궁뎅이 버섯균사체를 배양 발효시켜 제조한 발효물의 항산화 활성을 확인한 결과, 항산화 활성 및 생체고분자의 산화적 손상에 대한 보호 작용, 세포사멸에 대한 보호 작용을 가지고 있음을 확인하였다.
- 2). 뽕잎 발효물의 ABTS radical 소거활성도 같은 농도에서 양성대조군 보다는 낮은 것으로 나타났지만 발효물의 농도가 증가함에 따라 활성이 유의하게(p<0.01) 증가하는 것을 확인 할 수 있었다.
- 1). 뽕잎 발효물의 DPPH radical 소거활성은 같은 농도에서 양성대조군 보다는 낮게 나타났지만 발효물 농도에 비례해서 활성이 증가됨을 알 수 있었다.
- H2O2를 처리하지 않은 세포에서는 활성산소 생성 시 발생하는 형광이 나타나지 않았으나 H2O2를 처리한 세포에서는 형광 정도가 선명하게 나타났다. 이는 H2O2 처리 세포에서 활성산소가 생성되었음을 나타낸 것이며 여기에 뽕잎 발효물 50 μg/mL을 처리한 결과 형광정도가 현저히 감소됨을 알 수 있었다(Fig. 6).
후속연구
- 활성산소의 증가는 뇌 해마에서 항산화 수준을 감소시키고 지질과산화물인 malondialdehyde와 caspase-3의 과발현 촉진으로 인한 신경 손상과 사멸을 가속화 시킨다고 알려져 있다[46-48]. 따라서 본 연구 결과는 뽕잎 발효물이 활성산소에 의한 산화적 손상으로부터 세포를 보호하는 것으로 생각되며 활성산소에 의해 야기되는 노화 및 여러 질병을 예방할 수 있는 식품 소재로 이용될 수 있음을 시사한다.
- 6). 이상과 같은 결과들을 통해 뽕잎 발효물은 H2O2 에 의해 유도된 세포사멸 억제기능 및 세포 내 활성산소 소거기능이 있으며, 활성산소에 의해 야기되는 노화 및 퇴행성 질환을 예방할 수 있을 것으로 사료된다. 활성산소의 증가는 뇌 해마에서 항산화 수준을 감소시키고 지질과산화물인 malondialdehyde와 caspase-3의 과발현 촉진으로 인한 신경 손상과 사멸을 가속화 시킨다고 알려져 있다[46-48].
- 이상과 같은 결과를 통해, 노루궁뎅이버섯 균사체-뽕잎 발효물은 항산화 활성을 가지며 세포의 산화적 손상을 효과적으로 억제하는 것으로 판단되어 이를 이용한 기능성 식품 개발 및 상업화에 기초적 자료를 제공할 것으로 사료된다.
- 따라서 본 연구에서는 뽕잎 천연물배지에 노루궁뎅이 버섯균사체를 배양시켜 제조한 발효물이 항산화 기능이 있는 지를 확인하고자 하였다. 이와 같은 연구는 노루궁뎅이 버섯균사체 발효물을 이용한 기능성 식품 소재 개발 및 산업화에 도움을 줄 것으로 생각된다.
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