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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 활용도가 낮은 층꽃나무 전초로부터 total phenolic compounds를 추출하여 항산화효과, 주름개선 및 미백 효과 등 미용 활성을 검정하고, 기능성을 가지는 천연 화장료 조성물로서의 가능성을 탐색하고자 하였다.
제안 방법
- 1 filter paper (Whatman, Maidstone, UK)로 여과한 후 필요에 따라 rotary vacuum evaporator (Eyela NE, Tokyo, Japan)에서 농축하여 시료의 total phenolic compounds의 농도를 맞추어 사용하였다. 고형분의 제조는 추출에서 여과 과정까지 동일하게 진행하였으며, 이후 물과 ethanol 추출물을 동결건조하여 사용하였다.
- 이는 고형분의 total phenolic compounds의 함량과 유사한 패턴을 나타내었으며 이를 통해 total phenolic compounds의 함량이 증가할수록 전자공여능이 증가한다는 것을 알 수 있었다. 따라서 항산화효과, 주름개선 및 미백 효과 등의 생리활성은 층꽃나무의 고형분 함량보다 조절된 total phenolic compounds의 농도에 의해 영향을 받을 것으로 판단되어 향후 실험에서는 total phenolic compounds의 함량을 조절하여 진행하였다. 이에 근거하여 층꽃나무 추출물에 함유된 total phenolic compounds의 최적추출 조건을 알아보기 위해 여러 가지 추출용매를 사용하여 농도에 따라 조제하여 total phenolic compounds의 함량을 측정하였다.
- 반응구는 시료용액 100 μL에 5 mL의 emulsion용액을 혼합하였으며, 대조구에는 시료 대신 증류수 100 μL를 첨가하여 vortex한 후 50 oC에서 30 분간 반응시켜 냉각시킨 후, 470 nm에서 흡광도를 측정하여 PF 값은 반응구의 흡광도/대조구의 흡광도의 비로 계산하였다.
- 반응구는 시료용액 50 μL와 ABTS solution 1 mL를 혼합하였으며 대조구에는 시료 대신 증류수 50 μL를 첨가하여 30초간 vortex한 후 2.5분간 반응시키고 734 nm에서 흡광도를 측정하여 ABTS radical 소거활성(%)은 (1−반응구의 흡광도/대조구의 흡광도)×100으로 계산하였다.
- 시료 추출은 물 추출물의 경우 건조 층꽃나무 분말 1 g에 증류수 200 mL를 가하고 용액이 100 mL가 될 때 까지 15분간 가열하여 증발시킨 후 냉각하여 상온에서 교반 추출하였으며, ethanol 추출물은 시료 1 g에 80 % ethanol 100 mL를 추출용매로 가하여 24시간 동안 상온에서 교반 추출하였다. 추출액은 Whatman No.
- 원심분리 한 액을 실온에서 10분간 방치 한 후 상층액을 취해 532 nm에서 흡광도를 측정하였으며, TBARs에 대한 저해율(%)은 (1−반응구의 TBARs μM/대조구의 TBARs μM)×100으로 계산하였다.
- 따라서 항산화효과, 주름개선 및 미백 효과 등의 생리활성은 층꽃나무의 고형분 함량보다 조절된 total phenolic compounds의 농도에 의해 영향을 받을 것으로 판단되어 향후 실험에서는 total phenolic compounds의 함량을 조절하여 진행하였다. 이에 근거하여 층꽃나무 추출물에 함유된 total phenolic compounds의 최적추출 조건을 알아보기 위해 여러 가지 추출용매를 사용하여 농도에 따라 조제하여 total phenolic compounds의 함량을 측정하였다. 층꽃나무를 다양한용매로 추출한 결과 Fig.
대상 데이터
- 따라서 본 연구에서는 80 % ethanol을 추출 용매로 사용하여 실험을 진행하였고 total phenolic compounds의 용해도와 안정성이 높은 물 추출물도(Yoon 등, 2005) ethanol 추출물과의 비교를 위해 시료 추출물로 사용하였다.
- 본 실험에서 사용한 층꽃나무(Caryopteris incana Miq.)는 2015년 11월 경주지역에서 채취하여, 45 dry oven (Jeiotech, Daejeon, Korea)에서 건조시킨 후 40 mesh로 분쇄하여 시료로 사용하였다.
데이터처리
- 모든 실험은 3회 반복 측정하였고 자료의 통계처리는 SPSS 7.5 for windows (Statistical Package for Social Science, Chicago, IL, USA)를 이용하여 평균 ± 표준편차(mean ± standard deviation)로 표시하였고 분산분석(ANOVA)과 Duncan의 다중범위검정 (Duncan’s multiple range test)을 실시하여 시료간의 유의차를 p <0.05 수준으로 비교 분석하였다.
이론/모형
- 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical에 대한 소거활성은 Blios (1958)의 방법에 준하여 측정하였다. 반응구는 각 시료 1 mL에 60 μM DPPH 3 mL를 넣었으며, 대조구에는 시료 대신 증류수 1 mL를 첨가하여 vortex한 후 실온에서 15분 동안 반응시킨 다음 517 nm에서 흡광도를 측정하여 DPPH radical 소거활성(%)은 (1−반응구의 흡광도/대조구의 흡광도)×100 으로 계산하였다.
- ABTS [2,2-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)] radical cation decolorization의 측정은 Pellegrin 등(1999)의 방법에 준하여 측정하였다. 7 mM ABTS 5 mL와 140 mM K2S2O8 88 μL를 섞어 암실에서 약 15시간 반응시켜 radical을 형성시켰다.
- Astringent 활성측정은 Lee 등(2002)의 방법에 준하여 측정하였다. 반응구는 피부 단백질과 유사한 혈액 단백질(hemoglobin)을 사용하여, 원심분리관 용기에 각각의 시료용액과 헤모글로빈 용액(Sigma-Aldrich Co.
- Collagenase 저해효과 측정은 Wunsch와 Heidrich (1963)의 방법에 준하여 측정하였다. 반응구는 0.
- Elastase 저해효과 측정은 James 등(1996)의 방법에 준하여 측정하였다. 반응구는 0.
- PF는 Andarwulan과 Shetty(1999)의 방법에 준하여 측정하였다.10 mg의 β-carotene을 50 mL의 chloroform에 녹인 용액 1 mL 를 evaporator용 수기에 넣고 40 oC water bath에서 chloroform 을 증류시킨 후 20 μL linoleic acid, 184 μL tween 40과 50 mL H2O2 를 가하여 emulsion을 만들었다.
- TBARs는 Buege와 Aust(1978)의 방법에 준하여 측정하였다. 반응구는 1 % linoleic acid와 1 % tween 40으로 emulsion을 만들고, 시료 0.
- Total phenolic compounds의 정량은 Folin과 Denis (1912)의 방법에 준하여 측정하였으며, 시료 추출물 1 mL에 95 % ethanol 1 mL와 증류수 5 mL를 첨가하고 1 N Folin-ciocalteu reagent 0.5 mL를 넣어 잘 섞어주고, 5분간 방치한 후, 종료시약 Na2CO3 1 mL를 가한 후, UV-visible spectrophotometer (Optizen 3220UV Mecasys, Daejeon, Korea)로 725 nm에서 1시간 이내에 측정하여 gallic acid를 이용한 표준곡선으로부터 양을 환산하였다.
- Tyrosinase 저해효과 측정은 Vincent와 Hearing(1987)의 방법에준하여 측정하였다. 반응구는 0.
성능/효과
- 65 mg/g으로 ethanol 추출물이 가장 높은 total phenolic compounds 함량을 나타내었다. Ethanol 농도에 따른 total phenolic compounds의 함량을 측정한 결과 Fig. 1D와 같이 ethanol 추출물의 total phenolic compounds 함량이 농도의존적으로 점점 증가하다가 80 %에서 12.50 mg/g으로 가장 높게 측정되었다.
- Kim 등(2014)이 노간주나무 물과 ethanol 추출물을 500 μg/mL 농도로 항산화를 측정한 결과 각각 55, 71 %로 층꽃나무 추출물보다 낮은 항산화 활성을 나타내었다. 따라서 층꽃나무 추출물에 함유되어 있는 total phenolic compounds가 높은 항산화 활성을 나타낸다는 것을 알 수 있었고, 천연 산화방지제로서의 활용 가능성도 보여주었다.
- 또한 100 μg/mL의농도로 조절된 층꽃나무의 total phenolic compounds와 고형분 100 μg의 생리활성을 비교하기 위해 전자공여능을 측정한 결과 Fig. 1-B에서와 같이 100 μg/mL의 농도로 조절된 층꽃나무의 total phenolic compounds에 의해 높은 전자공여능이 나타났으며, 고형분 100 μg에서는 물과 ethanol 각각 27, 43 %로 상대적으로 낮은 전자공여능이 나타났다.
- 1-B에서와 같이 100 μg/mL의 농도로 조절된 층꽃나무의 total phenolic compounds에 의해 높은 전자공여능이 나타났으며, 고형분 100 μg에서는 물과 ethanol 각각 27, 43 %로 상대적으로 낮은 전자공여능이 나타났다. 이는 고형분의 total phenolic compounds의 함량과 유사한 패턴을 나타내었으며 이를 통해 total phenolic compounds의 함량이 증가할수록 전자공여능이 증가한다는 것을 알 수 있었다. 따라서 항산화효과, 주름개선 및 미백 효과 등의 생리활성은 층꽃나무의 고형분 함량보다 조절된 total phenolic compounds의 농도에 의해 영향을 받을 것으로 판단되어 향후 실험에서는 total phenolic compounds의 함량을 조절하여 진행하였다.
- 이러한 주름 유발과 관련된 elastase 저해활성을 측정한 결과 Fig. 3과 같이 물추출물에서는 효과가 나타나지 않았으며, ethanol 추출물에서는 200 μg/mL의 농도에서 58 %의 elastase 저해활성을 나타내었다.
- 층꽃나무 물과 ethanol 추출물로 tyrosinase 저해활성을 측정한 결과 Fig. 5와 같이 물 추출물에서는 저해활성이 나타나지 않았지만, ethanol 추출물에서는 농도의존적으로 tyrosinase 저해활성이 증가하였고 200 μg/mL의농도에서 13 %의 미백 효과를 나타내었다.
- 층꽃나무 물과 ethanol 추출물로 수렴효과를 측정한 결과 Fig. 6에서와 같이 물 추출물에서는 수렴 효과가 나타나지 않았지만, ethanol 추출물에서는 50~200 μg/ mL의 농도에서 각각 15~50 %의 수렴효과를 나타내어 대조군으로 사용한 tannic acid보다 월등히 우수한 수렴효과를 나타내었다.
- 층꽃나무 추출물로 collagenase의 저해활성을 측정한 결과 Fig. 4와 같이 물 추출물 에서 효과가 나타나지 않았으며, ethanol 추출물에서는 50~200 μg/mL의 농도에서 모두 75 % 이상의 collagenase 저해활성을 나타내었다.
- 층꽃나무 추출물을 이용하여 ABTS radical 소거능을 측정한 결과 Fig. 2B와 같이 물과 ethanol 추출물 모두 100~200 μg/mL의농도에서 90 % 이상의 높은 활성을 나타내었으며, 대조군으로 사용한 BHT보다 더 우수한 효능을 나타내었다.
- 층꽃나무 추출물을 이용하여 TBARs를 측정한 결과 Fig. 2-D와 같이 물과 ethanol 추출물 100~200 μg/mL의 농도에서 각각 60, 80 % 이상의 활성을 나타내었다.
- 층꽃나무 추출물을 이용하여 전자공여능을 측정한 결과 Fig. 2A와 같이 물 추출물은 50~200 μg/mL의 농도에서 모두 약 84 %의 전자공여능을 나타내었고, 80 % ethanol 추출물은 84~92 %로 농도의존적으로 증가하였다.
- 이에 근거하여 층꽃나무 추출물에 함유된 total phenolic compounds의 최적추출 조건을 알아보기 위해 여러 가지 추출용매를 사용하여 농도에 따라 조제하여 total phenolic compounds의 함량을 측정하였다. 층꽃나무를 다양한용매로 추출한 결과 Fig. 1C와 같이 water, ethanol, methanol, acetone, butanol 추출물에서 각각 7.69, 11.47, 9.95, 6.51, 8.65 mg/g으로 ethanol 추출물이 가장 높은 total phenolic compounds 함량을 나타내었다. Ethanol 농도에 따른 total phenolic compounds의 함량을 측정한 결과 Fig.
- 층꽃나무에 함유된 total phenolic compounds의 추출 수율을 확인하고자, 물과 ethanol로 추출한 고형분 100 μg의 total phenolic compounds 함량을 측정한 결과 각각 25.56, 36.68 μg/g으로 매 우 낮게 함유되어 있음을 확인할 수 있었다.
- 특히 200 μg/mL의 농도에서 89 %의 우수한 저해활성을 나타내었다.
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