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문제 정의
- UVB에 의한 세포 손상으로 인한 ROS의 생성을 측정하기 위한 실험을 진행하였다. HaCaT cells를 3×105 cells/mL의 농도로 부유시켜 96-well plate에 분주하여 24시간 동안 incubation 하였다.
- 조생종인 흑진주벼와 조생흑찰은 안토시아닌 고함유 메벼, 흑자색 찰벼이며, 흑설은 중부 평야지에 적응하고 가공용 연질미로 개발되었으며, 중만생종인 신농흑찰과 신토흑미는 각각 안토시아닌 고함유 흑색찰벼와 메벼 품종이다(22). 최근 유색미에 대한 생리활성을 과학적으로 증명하기 위한 연구가 활발히 진행되고 있으나 아직 유색미에 대한 항주름 활성에 대한 연구는 거의 이루어지지 않았으므로, 본 연구는 흑미 가운데 in vitro 상태에서 높은 항산화 작용을 나타낸다고 알려진 조생흑찰, 신농흑찰, 신토흑미, 흑진주벼, 흑설을 선별하여 이들의 자외선 조사에 의한 주름 생성을 억제하는 효능을 분석하여 주름개선 소재로서의 가능성을 알아보고자 하였다.
제안 방법
- Cell lysate로 Bradford assay 방법으로 단백질 정량하여 10 μL의 단백질을 10%의 SDS-PAGE에서 전기영동하여 분리하고 원하는 부위의 gel을 잘라 3시간 동안 nitrocellulose(NC) membrane에 옮긴 다음, 4°C에서 1시간 동안 5% skim milk로 blocking 한 후 primary antibody(Santa Cruz Biotechnology, Inc., Dallas, TX, USA)를 1:1,000으로 희석하여 4°C에서 overnight 한 다음, 다시 30분 간격으로 TBST로 3회 washing 하고 각각의 HRP-conjugated secondary antibody(Santa Cruz Biotechnology, Inc.)를 희석하여 상온에서 1시간 동안 처리하고 3회 washing 한 후 ECL 용액을 가한 다음 Western imaging system(EZ-Capture MG, ATTO, Tokyo, Japan) 기기를 이용하여 밴드 확인 및 정량하였다.
- Collagenase 저해 활성 측정은 Cannell 등(25)의 방법을 변형하여 다음과 같이 측정하였다. 즉 반응구는 0.
- DCF 형광도는 excitation 485 nm, emission 530 nm의 파장에서 infinite PRO(INFINITE F200 PRO, TECAN, Grödig, Austria)로 분석하여 축적된 ROS에 결합된 형광 DCF-DA를 측정하여 대조군에 대한 상대적인 수치로 나타내었다.
- RNA는 High Pure RNA Isolation Kit(Roche, Basel, Switzerland)을 이용하였으며 제조회사의 방법에 따라 total RNA를 추출하였으며, 1 μg/μL의 농도로 정량하고 추출된 total RNA는 Transcriptor first Stand cDNA synthesis kit(Roche)을 이용하여 역전사를 진행시켜 cDNA를 합성시켰다.
- RT-PCR 증폭으로 생산된 DNA는 0.5 μg/mL의 ethidium bromide가 포함된 1% metaphor agarose gel에 전기영동하여 cooled CCD camera system EZ-Capture Ⅱ와 CA analyzer ver. 3.00 software(ATTO, Tokyo, Japan)를 이용하여 mRNA의 발현 정도를 확인하였다.
- 4B에서 나타낸 바와 같이 HE가 전 농도에서 92% 이상의 세포 생존율을 보였다. 따라서 단백질 발현 및 mRNA 발현에 관한 실험을 진행하기 위하여 유색미 5종 가운데 HE를 선별하였으며, UVB를 HaCaT cell에 50 mJ/cm2의 자극을 주는 조건으로 진행하였다.
- 배지를 제거하고 형광염료인 20 μM 2’,7’-dichlorofluorescein diacetate(DCFH-DA, SigmaAldrich Co.)를 90 μL 처리하여 20분간 배양한 후 시료 용액을 농도별로 선 처리하여 1시간 동안 배양한 다음, DCFHDA를 제거하고 PBS로 3번 washing 한 후 UVB(50 mJ/cm2)를 조사하고 30분간 다시 배양한 다음 형광도를 측정하였다.
- 선별된 유색미 5종에 대한 사람각질세포인 HaCaT 세포에서의 생존율을 확인하기 위하여 MTT assay를 실시하였으며, 그 결과는 Fig. 4A에 나타내었다. HaCaT 세포에 대하여 25 μg/mL의 농도에서 JE, SE, SRE, HRE, HE, 그리고 HRW가 95~100%의 세포 생존율을 나타내었고 100 μg/mL의 농도에서는 JE, HRE, HE, HRW가 모두 80% 이상의 생존율을 보였다.
- 선별된 유색미 중 활성산소종을 유의하게 억제시킨 HE에 대한 MMPs의 mRNA 발현에 미치는 영향을 관찰하고자 HaCaT 세포에 HE를 다양한 농도로 처치한 후 UVB로 자극한 다음 24시간 배양하여 총 RNA를 추출하였고 RT-PCR을 이용하여 분석하였다. 그 결과(Fig.
- 열수 추출의 경우 시료 중량의 10배 양의 증류수를 첨가하여 85°C에서 3시간 환류냉각 추출하였으며(JW, SW, SRW, HRW, HW), 에탄올 추출의 경우 70% 에탄올에 침지하여 상온에서 24시간 방치한 후 상징액과 침전물을 분리하여 3회 반복 추출하였다(JE, SE, SRE, HRE, HE).
- RNA는 High Pure RNA Isolation Kit(Roche, Basel, Switzerland)을 이용하였으며 제조회사의 방법에 따라 total RNA를 추출하였으며, 1 μg/μL의 농도로 정량하고 추출된 total RNA는 Transcriptor first Stand cDNA synthesis kit(Roche)을 이용하여 역전사를 진행시켜 cDNA를 합성시켰다. 유전자 발현은 Fast start Essential DNA Green Master kit(Roche)을 사용하여 RT-PCR을 수행하였다. 이 분석에서 internal control은 β-actin을 사용하였고 primer의 sequences는 다음과 같다.
- 전자공여능은 Blois(23)의 방법을 변형하여 다음과 같이 측정하였다. 각 시료 용액 100 μL에 0.
대상 데이터
- Human 유래 keratinocyte cell line인 HaCaT cells은 German Cancer Research Center(DKFZ, Heidelberg, Germany)로부터 공급받았으며, 10% FBS와 penicillin/streptomycin(Sigma-Aldrich Co.) 100 unit/mL가 함유된 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM, Gibco BRL Co., Grand Island, NY, USA) 배지를 사용하여 37°C, 5% CO2 incubator(MCO-18AIC, SANYO Co., Sakata, Japan)에서 배양하였으며, 2~3일에 한 번씩 계대 배양을 시행하였다.
- 본 실험에 사용된 선별된 유색미 5종인 조생흑찰(J), 신농흑찰(S), 신토흑미(SR), 흑진주벼(HR) 그리고 흑설(H)은 2015년 국립식량과학원(Miryang, Korea)에서 제공받아 열수 및 에탄올 추출을 실시하였다. 열수 추출의 경우 시료 중량의 10배 양의 증류수를 첨가하여 85°C에서 3시간 환류냉각 추출하였으며(JW, SW, SRW, HRW, HW), 에탄올 추출의 경우 70% 에탄올에 침지하여 상온에서 24시간 방치한 후 상징액과 침전물을 분리하여 3회 반복 추출하였다(JE, SE, SRE, HRE, HE).
- 즉 7.4 mM 2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS, Sigma-Aldrich Co.) 0.5 mL와 2.6 mM potassium persulfate(K2S2O8) 88μL를 섞은 용액 1 mL와 에탄올 88 mL를 혼합한 ABTS 용액 1 mL를 1:1로 섞은 후 12시간 동안 라디칼을 형성시킨 용액을 99% 에탄올에 약 1:13의 비율로 섞어서 734 nm에서 대조구의 흡광도 값이 0.7±0.002가 되도록 조절한 ABTS 용액을 사용하였다.
데이터처리
- 실험 결과에 대한 통계처리는 SPSS 22.0(IBM SPSS Inc., New York, NY, USA)을 이용하여 평균과 표준편차로 나타내었고, 각 처리군 간의 유의성에 대한 검증은 ANOVA를 이용하여 유의성을 확인한 후, P<0.05 수준에서 Duncan’s multiple range test를 이용하여 분석하였다.
이론/모형
- ABTS 라디칼 소거활성의 측정은 Park과 Kang(24)의 방법에 의해 측정하였다. 즉 7.
- 세포 생존율 측정은 Mosmann(26)의 방법에 따라 측정하였다. HaCaT cell을 96-well plate에 1×106 cells/well이 되게 0.
성능/효과
- MAPK pathways는 자외선 조사를 포함하는 세포 외 자극들에 대응하여 활성화되고(41), MAPK signaling은 MMP 분비를 포함한 다양한 세포 과정에서 중요한 조절 역할을 수행하여(42) 조기 피부노화와 노화된 피부의 특징인 피부 주름을 야기한다고 알려져 있다. Fig. 6에서 나타낸 바와 같이 HE가 ERK와 p38의 인산화를 농도 의존적으로 억제하고 있음을 확인하였다.
- HaCaT 세포에 대하여 25 μg/mL의 농도에서 JE, SE, SRE, HRE, HE, 그리고 HRW가 95~100%의 세포 생존율을 나타내었고 100 μg/mL의 농도에서는 JE, HRE, HE, HRW가 모두 80% 이상의 생존율을 보였다.
- SRW와 HW가 전 농도에서 양성 대조군인 BHT보다 모두 높은 ABTS 라디칼 소거능을 보였고, 50 μg/mL 이상에서는 유색미 5종의 열수와 에탄올 추출물 모두 72% 이상의 우수한 소거능을 보였다.
- UVB 자극을 준 세포에 HE를 농도별로 처치하였을 때 pro-collagen type Ⅰ은 100 μg/mL의 농도에서 발현이 증가하였고, MMP-1과 -13은 농도 의존적으로 발현이 억제되었으나, MMP-3과 -8의 발현에는 크게 영향을 주지 않은 것을 확인할 수 있었다.
- 그 결과(Fig. 7) MMP-1, -3의 mRNA의 발현은 농도 의존적으로 감소시켰으며, MMP-9의 경우 HE를 100 μg/mL의 농도로 처치한 경우에 발현을 감소시켰음을 확인하였다.
- HaCaT 세포에 대하여 25 μg/mL의 농도에서 JE, SE, SRE, HRE, HE, 그리고 HRW가 95~100%의 세포 생존율을 나타내었고 100 μg/mL의 농도에서는 JE, HRE, HE, HRW가 모두 80% 이상의 생존율을 보였다. 그 결과를 바탕으로 선별된 유색미 5종 가운데 에탄올 추출물에 대하여 UVB를 조사(50 mJ/cm2)한 후의 세포 생존율을 측정하였으며, 그 결과는 Fig. 4B에서 나타낸 바와 같이 HE가 전 농도에서 92% 이상의 세포 생존율을 보였다. 따라서 단백질 발현 및 mRNA 발현에 관한 실험을 진행하기 위하여 유색미 5종 가운데 HE를 선별하였으며, UVB를 HaCaT cell에 50 mJ/cm2의 자극을 주는 조건으로 진행하였다.
- 특히 MMP-1의 발현이 자외선을 조사하지 않은 대조군(Non)보다도 억제되었으며, 이는 Lee 등(39)이 보고한 한방 발효주 주박 추출물의 MMP-1 발현억제 실험 결과에서 자외선을 조사한 HaCaT cell에서의 MMP-1 발현이 50과 100 μg/mL의 농도에서 Non보다도 억제된 것과 유사한 결과임을 확인할 수 있었다. 반면에 MMP-3의 발현억제 결과에서는 HE의 농도가 증가할수록 오히려 발현이 증가하였으며, 이는 HE가 UVB의 조사로 인한 MMP-3의 발현억제에 대한 효능이 없음을 알 수 있었다.
- 선별된 유색미 5종 가운데 에탄올 추출물들은 대부분 농도 의존적으로 높은 활성산소종 저해효능을 보였으며 그중 SE, HE가 전 농도에서 매우 효과적인 저해효과를 나타내었고, 특히 25 μg/mL의 농도에서 자외선 조사군(Con)과 비교하여 각각 83.7%, 82.8%의 억제효과를 나타내었다.
- 8%의 억제효과를 나타내었다. 열수 추출물의 경우는 효과가 약하였으나 SW만이 Con과 비교하여 약 45%의 저해효능을 나타내었다. 한편 Kim 등(35)은 UVB를 조사한 HaCaT cell에서의 머위 추출물의 ROS 생성억제효과를 실험한 결과 Con과 비교하여 500 μg/mL의 농도에서 45% 이상의 소거효능을 나타내었다고 한 보고와 비교하였을 때, 우리의 결과가 활성산소종 발현억제 효능이 매우 뛰어남을 확인할 수 있었다.
- 유색미 5종의 에탄올 추출물 대부분이 25 μg/mL 농도에서 66% 이상의 높은 DPPH 라디칼 소거능을 보였으며, 특히 SRE와 HE는 100 μg/mL에서 84% 이상의 소거능을 보였으며 양성대조군인 BHT가 100 μg/mL에서 95.9%의 소거능을 보인 것과 비교하여 유의할만한 효과라고 볼 수 있다.
- 유색미 에탄올 추출물 모두 25 μg/mL의 농도에서 약 58% 이상의 효소 저해능을 나타내었고, 특히 HE는 25, 50 및 100 μg/mL의 농도에서 각각 약 76%, 89% 및 92%로 고르게 높은 저해효능을 보였다.
- 유색미에 대한 collagenase 저해능의 보고는 미흡한 실정이며, Min 등(34)이 보고한 단삼의 에탄올 추출물에 대한 분획물 가운데 chloroform fraction 1%의 농도에서 88.2±2.1%의 저해활성을 나타낸 결과와 비교했을 때, 본 결과가 낮은 농도에서 높은 collagenase 저해 효능을 나타내고 있음을 확인할 수 있었다.
- 1%라고 보고하였다. 이러한 기존의 연구 결과와 비교하였을 때 선별된 유색미 5종의 우수한 항산화 활성을 확인할 수 있었다.
- 특히 MMP-1의 발현이 자외선을 조사하지 않은 대조군(Non)보다도 억제되었으며, 이는 Lee 등(39)이 보고한 한방 발효주 주박 추출물의 MMP-1 발현억제 실험 결과에서 자외선을 조사한 HaCaT cell에서의 MMP-1 발현이 50과 100 μg/mL의 농도에서 Non보다도 억제된 것과 유사한 결과임을 확인할 수 있었다.
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