RAW 264.7 큰포식세포에서 상백피 및 상지 에탄올 추출물의 항염증 활성 비교 Anti-inflammatory effects of ethanolic mulberry extract on the murine macrophage cell line, RAW 264.7원문보기
상백피 및 상지에탄올 추출물의 항염증 효과를 확인하기 위하여 RAW 264.7 세포를 사용하여 시험하였다. 상백피, 상지 추출물의 활성산소종, 산화질소(II), 프로스타글란딘$E_2$, 인터류킨-6, 종양괴사인자-${\alpha}$ 등의 생성능과 COX-2, iNOSmRNA 발현을 확인하였다. 산화질소(II) 생성량은 두 추출물 모두 유의하게 비슷한 정도로 감소시켰으나, 활성산소종 생성에서는 상백피 추출물이 상지 추출물 보다 억제 효과가 높게 나타났다. 프로스타글란딘 $E_2$와 인터류킨-6 생성에서는 상지 추출물의 억제 효과가 강하게 나타났으며, COX-2와 iNOS mRNA 발현량 또한 상지 추출물의 상백피에 비해 유의하게 감소시킴을 확인하였다. 본 연구에서 확인한 결과로 상백피, 상지 추출물 모두 염증 매개인자 발현 억제를 통해 항염증 효과를 가짐을 알 수 있었으며, 상지 추출물이 상백피 추출물 보다 염증 완화 효과가 강한 것으로 나타났다. 향후에는 상백피 및 상지 추출물의 주요 활성 성분들의 차이와, 염증완화 메커니즘을 통한 관련 질환에 효과가 있는지 정확한 작용메커니즘 확인 등의 분석실험이 필요할 것으로 생각된다.
상백피 및 상지 에탄올 추출물의 항염증 효과를 확인하기 위하여 RAW 264.7 세포를 사용하여 시험하였다. 상백피, 상지 추출물의 활성산소종, 산화질소(II), 프로스타글란딘 $E_2$, 인터류킨-6, 종양괴사인자-${\alpha}$ 등의 생성능과 COX-2, iNOS mRNA 발현을 확인하였다. 산화질소(II) 생성량은 두 추출물 모두 유의하게 비슷한 정도로 감소시켰으나, 활성산소종 생성에서는 상백피 추출물이 상지 추출물 보다 억제 효과가 높게 나타났다. 프로스타글란딘 $E_2$와 인터류킨-6 생성에서는 상지 추출물의 억제 효과가 강하게 나타났으며, COX-2와 iNOS mRNA 발현량 또한 상지 추출물의 상백피에 비해 유의하게 감소시킴을 확인하였다. 본 연구에서 확인한 결과로 상백피, 상지 추출물 모두 염증 매개인자 발현 억제를 통해 항염증 효과를 가짐을 알 수 있었으며, 상지 추출물이 상백피 추출물 보다 염증 완화 효과가 강한 것으로 나타났다. 향후에는 상백피 및 상지 추출물의 주요 활성 성분들의 차이와, 염증완화 메커니즘을 통한 관련 질환에 효과가 있는지 정확한 작용메커니즘 확인 등의 분석실험이 필요할 것으로 생각된다.
The aim of this study was to compare the anti-inflammatory effects of ethanol extracts of root peel and spear of mulberry (RME and SME, respectively) in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated RAW 264.7 macrophages. Both extracts significantly inhibited the production of reactive oxygen species (ROS), n...
The aim of this study was to compare the anti-inflammatory effects of ethanol extracts of root peel and spear of mulberry (RME and SME, respectively) in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated RAW 264.7 macrophages. Both extracts significantly inhibited the production of reactive oxygen species (ROS), nitric oxide (NO), and interleukin-6 (IL-6). However, prostaglandin $E_2$ ($PGE_2$) levels decreased in LPS-stimulated RAW 264.7 cells treated with SME. Additionally, the extracts reduced inducible NO synthase (iNOS) expression and cyclooxygenase-2 (COX-2) in mRNA levels. Although ROS production was lower in the RME-treated cells than in the SME-treated cells, the levels of other inflammatory parameters, including IL-6 and $PGE_2$, and mRNA levels of iNOS and COX-2 reduced more in the SME-treated cells. These results indicate that SME showed higher anti-inflammatory activities than RME. Therefore, SME can be used as a functional food ingredient to enhance health.
The aim of this study was to compare the anti-inflammatory effects of ethanol extracts of root peel and spear of mulberry (RME and SME, respectively) in lipopolysaccharide (LPS)-stimulated RAW 264.7 macrophages. Both extracts significantly inhibited the production of reactive oxygen species (ROS), nitric oxide (NO), and interleukin-6 (IL-6). However, prostaglandin $E_2$ ($PGE_2$) levels decreased in LPS-stimulated RAW 264.7 cells treated with SME. Additionally, the extracts reduced inducible NO synthase (iNOS) expression and cyclooxygenase-2 (COX-2) in mRNA levels. Although ROS production was lower in the RME-treated cells than in the SME-treated cells, the levels of other inflammatory parameters, including IL-6 and $PGE_2$, and mRNA levels of iNOS and COX-2 reduced more in the SME-treated cells. These results indicate that SME showed higher anti-inflammatory activities than RME. Therefore, SME can be used as a functional food ingredient to enhance health.
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문제 정의
현재까지 다양한 뽕나무 추출물의 생리활성이 보고되었음에도 불구하고, 상지와 상백피 추출물의 염증 억제 효과를 비교한 연구는 미비하다. 따라서 본 연구에서는 RAW 264.7 세포를 이용하여 상지 및 상백피 추출물이 염증인자 산화질소(II), 프로스타글란딘 E2, 전염증인 자인 인터류킨-6, 종양괴사인자-α의 억제 뿐 만아니라 polymerase chain reaction (PCR)을 이용하여 염증 유발과 관련된 iNOS, COX-2 mRNA의 발현 억제를 확인하고자 하였다.
제안 방법
상백피, 상지 추출물의 염증 반응 관련 mRNA 발현 억제를 확인하기 위해 RT-PCR을 이용하여 COX-2와 iNOS mRNA 발현량을 확인하였다(Fig. 3).
상백피, 상지 추출물의 염증성 사이토카인 생성량 저하 효과를 확인하기 위해 인터류킨-6와 종양괴사인자-α 분비 수준을 측정하였다(Fig. 1).
대상 데이터
본 연구에 사용된 상지 및 상백피는 2012년 6월 경북 영천에서 재배한 것으로 봄에 잎이 내돋지 않은 때에 청일뽕 뽕나무로부터 채취 후 곧바로 50℃ 이하 열풍건조기(COBP-15S, Shinheung, Cheongju, Korea)에서 건조한 것을 재료로 사용하였다. 뽕나무 부위 즉, 상지 및 상백피의 기능성 물질 함량 분석을 위한 에탄올추출물의 조제는 다음과 같이 실시하였다(12).
본 연구에서 사용한 쥐의 큰포식세포인 RAW 264.7 세포(KCLB40071)는 한국세포주은행(Seoul, Korea)에서 구입하였다. 세포배양에 사용된 10% 소태아혈청(FBS), 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)과 1% HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)가 함유된 둘베코수정이글배지(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)는 Gibco (Grand Island, NY, USA)에서 구입하였다.
상백피 및 상지 에탄올 추출물의 항염증 효과를 확인하기 위하여 RAW 264.7 세포를 사용하여 시험하였다. 상백피, 상지 추출물의 활성산소종, 산화질소(II), 프로스타글란딘 E2, 인터류킨-6, 종양괴사인자-α 등의 생성능과 COX-2, iNOS mRNA 발현을 확인하였다.
7 세포(KCLB40071)는 한국세포주은행(Seoul, Korea)에서 구입하였다. 세포배양에 사용된 10% 소태아혈청(FBS), 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)과 1% HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)가 함유된 둘베코수정이글배지(Dulbecco’s modified Eagle’s medium)는 Gibco (Grand Island, NY, USA)에서 구입하였다. 배지는 1-2일에 한 번씩 교체하였으며, 5% 이산화탄소(CO2)가스가 존재하는 37℃ 배양기에서 진행되었다.
데이터처리
)로 나타내었다. 군간분석 항목별 차이는 일원배치 분산분석(one-way analysis of variance)를 수행한 후, 던컨의 다중검정(Ducan’s multiple range test)로 p<0.05 수준에서 유의차 검정을 실시하였다.
모든 실험 결과는 3회 반복으로 실시한 평균과 표준편차로 나타내었으며, 각 실험결과에 대한 통계분석은 SPSS 20.0 (Statistical Package for S℃ial, SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 소프트웨어를 이용하여 분석하였으며, 평균±표준오차(S.E.)로 나타내었다. 군간분석 항목별 차이는 일원배치 분산분석(one-way analysis of variance)를 수행한 후, 던컨의 다중검정(Ducan’s multiple range test)로 p<0.
이론/모형
95℃에서 10분 동안 초기변성 후에 95℃10초, 60℃ 30초 동안 2단계에 걸쳐서 40 cycle을 진행하여 증폭 하였다. PCR 결과로부터 각각의 유전자의 상대적인 정량분석은 베타액틴(β-actin)에 대한 조사하고자 하는 유전자의 PCR 생성물의 상대적인 비율로 계산한 뒤, ΔCT법을 이용하여 mRNA 생성량을 계산하였다.
RAW 264.7세포의 상지 및 상백피에 대한 세포생존율 평가는 3-(4,5-dimethylthiazol-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide (MTT) 방법을 통해 분석하였다. 세포를 1×105 cells/mL의 농도로 하여 96 well plate의 각 well에 180 μL씩 분주하고, 24시간 배양하여 세포를 부착시켰다.
배양액 내의 산화질소(II)함량 측정은 아질산염(nitrite)를 산화질소(II) 생산의 지표로 이용한 Griess 반응을 이용하여 실시하였다. 각 세포들을 96 well plate에 1×105 cells/mL 농도로 180 μL 분주한 다음 37℃, 5% 이산화탄소 배양기에서 24시간 배양한 후 추출물을 최종농도가 10 μg/mL가 되도록 처리하였다.
성능/효과
3). 그 결과 COX-2에서 지방질다당류 처리군의 COX-2 mRNA 생성량 증가는 4.23±0.08배, iNOS의 mRNA 증가는 3.29±0.22로 현저히 증가되는 결과를 확인하였으며, 상지, 상백피 추출물 모두 COX-2와 iNOS mRNA 발현량을 유의하게 감소시켰다. 특히, 상백피 추출물 보다 상지 추출물이 COX-2와 iNOS mRNA 생성량을 유의하게 감소시킨 것으로 확인되었다(p<0.
프로스타글란딘 E2와 인터류킨-6 생성에서는 상지 추출물의 억제 효과가 강하게 나타났으며, COX-2와 iNOS mRNA 발현량 또한 상지 추출물의 상백피에 비해 유의하게 감소시킴을 확인하였다. 본 연구에서 확인한 결과로 상백피, 상지 추출물 모두 염증 매개인자 발현 억제를 통해 항염증 효과를 가짐을 알 수 있었으며, 상지 추출물이 상백피 추출물 보다 염증 완화 효과가 강한 것으로 나타났다. 향후에는 상백피 및 상지 추출물의 주요 활성 성분들의 차이와, 염증완화 메커니즘을 통한 관련 질환에 효과가 있는지 정확한 작용메커니즘 확인 등의 분석실험이 필요할 것으로 생각된다.
본 연구에서 활성산소종 생성량으로 확인한 산화방지 효과는 상백피 에탄올 추출물이 더 좋은 효과를 보였다. 본 연구결과와 유사하게 Khan 등(21)의 연구에 의하면 상백피 추출물의 총 폴리페놀 함량과 플라보노이드 함량이 상지 추출물보다 높은 것으로 나타났고, α, α-diphenyl-β-picrylhydrazyl (DPPH), 하이드록실 라디칼 제거(hydroxyl radical scavenging) 등의 실험에서 상백피 추출물의 효과가 상지 추출물의 효과보다 높은 것으로 나타났다.
상백피, 상지 추출물의 활성산소종, 산화질소(II), 프로스타글란딘 E2, 인터류킨-6, 종양괴사인자-α 등의 생성능과 COX-2, iNOS mRNA 발현을 확인하였다. 산화질소(II) 생성량은 두 추출물 모두 유의하게 비슷한 정도로 감소시켰으나, 활성산소종 생성에서는 상백피 추출물이 상지 추출물 보다 억제 효과가 높게 나타났다. 프로스타글란딘 E2와 인터류킨-6 생성에서는 상지 추출물의 억제 효과가 강하게 나타났으며, COX-2와 iNOS mRNA 발현량 또한 상지 추출물의 상백피에 비해 유의하게 감소시킴을 확인하였다.
측정 결과, 지방질다당류를 처리하지 않은 군에 비해 처리한 군에서 활성산소종 양이 12% 증가함을 보였고 상백피 추출물은 지방질다당류유도 군 대비 활성산소종 양을 35% 감소시켰으며, 상지 추출물 또한 지방질다당류에 의한 활성산소종의 생성을 12% 감소시켜 지방질다당류 비처리군과 동일한 수준의 활성산소종 생성을 보였다. 이 두 추출물 중 상백피 추출물이 상지 추출물보다 활성산소종 생성을 유의하게 더 억제함을 확인할 수 있었다(p<0.05).
특히 염증과정 중에 COX-2와 iNOS에 의해 산화질소(II), 프로스타글란딘 E2가 생성되는데(24,25), COX-2는 큰포식세포와 활막세포 같은 염증세포에서 감염, 상처, 스트레스 인자에 의해 아라키도닉산(arachidonic acid)으로부터 발생하는 많은 양의 프로스타글란딘을 생성시켜 침해 수용체를 활성화하고 염증상태로 유도하며(26,27), iNOS 또한 산화질소(II)를 합성하는 NO synthase (NOS)의 나머지 두 가지 형태인 neuronal NOS (nNOS), endothelial NOS (eNOS)와 다르게 다양한 염증 유도 사이토카인 등에 의해 노출되는 경우에만 발현한다(28). 이번 연구에서는 상백피 및 상지 추출물의 처리는 지방질다당류로 자극한 RAW 264.7 세포에서 전구 염증 매개인자들의 유전자 발현을 억제함으로써 염증반응을 촉발하는 전구 염증 매개인자들의 생산을 감소시킬 것으로 확인되었다. 특히 상백피, 상지 추출물을 비교한 결과, 상지 추출물이 상백피 추출물보다 프로스타글란딘 E2, 인터류킨-6 생성량과 COX-2, iNOS mRNA 발현량을 유의적으로 감소시키는 것으로 나타나 상지 추출물이 항염증 효과가 더 좋은 것으로 나타났다.
1). 지방질다당류 처리에 의해 인터류킨-6 생성량이 현저하게 증가했으며, 상지, 상백피 추출물 처리 모두 인터류킨-6 생성량이 유의하게 감소하였다. 하지만 상백피 추출물 처리군의 인터류킨-6 생성량은 약 75 pg/mL 감소한 반면, 상지 추출물 처리군에서는 약 450 pg/mL 감소한 것으로 확인되어 상지 추출물의 염증성 사이토카인 억제 능력이 통계적 유의성을 가지며 훨씬 우수한 것으로 확인되었다(p<0.
추출물을 24시간 전처리하고 지방질다당류로 유도된 활성산소종을 시료 및 지방질다당류 무첨가군의 흡광도 평균값에 대한 상대적인 백분율로 표시하였다. 측정 결과, 지방질다당류를 처리하지 않은 군에 비해 처리한 군에서 활성산소종 양이 12% 증가함을 보였고 상백피 추출물은 지방질다당류유도 군 대비 활성산소종 양을 35% 감소시켰으며, 상지 추출물 또한 지방질다당류에 의한 활성산소종의 생성을 12% 감소시켜 지방질다당류 비처리군과 동일한 수준의 활성산소종 생성을 보였다. 이 두 추출물 중 상백피 추출물이 상지 추출물보다 활성산소종 생성을 유의하게 더 억제함을 확인할 수 있었다(p<0.
7 세포에서 전구 염증 매개인자들의 유전자 발현을 억제함으로써 염증반응을 촉발하는 전구 염증 매개인자들의 생산을 감소시킬 것으로 확인되었다. 특히 상백피, 상지 추출물을 비교한 결과, 상지 추출물이 상백피 추출물보다 프로스타글란딘 E2, 인터류킨-6 생성량과 COX-2, iNOS mRNA 발현량을 유의적으로 감소시키는 것으로 나타나 상지 추출물이 항염증 효과가 더 좋은 것으로 나타났다. 본 연구는 상백피 및 상지 추출물의 항염증 활성을 mRNA 수준에서만 진행하였는데 다음 연구에서는 관련 효소 활성도 및 단백질 수준에서의 변화를 제시하는 연구가 진행되어야 할 것으로 사료된다.
22로 현저히 증가되는 결과를 확인하였으며, 상지, 상백피 추출물 모두 COX-2와 iNOS mRNA 발현량을 유의하게 감소시켰다. 특히, 상백피 추출물 보다 상지 추출물이 COX-2와 iNOS mRNA 생성량을 유의하게 감소시킨 것으로 확인되었다(p<0.05).
산화질소(II) 생성량은 두 추출물 모두 유의하게 비슷한 정도로 감소시켰으나, 활성산소종 생성에서는 상백피 추출물이 상지 추출물 보다 억제 효과가 높게 나타났다. 프로스타글란딘 E2와 인터류킨-6 생성에서는 상지 추출물의 억제 효과가 강하게 나타났으며, COX-2와 iNOS mRNA 발현량 또한 상지 추출물의 상백피에 비해 유의하게 감소시킴을 확인하였다. 본 연구에서 확인한 결과로 상백피, 상지 추출물 모두 염증 매개인자 발현 억제를 통해 항염증 효과를 가짐을 알 수 있었으며, 상지 추출물이 상백피 추출물 보다 염증 완화 효과가 강한 것으로 나타났다.
지방질다당류 처리에 의해 인터류킨-6 생성량이 현저하게 증가했으며, 상지, 상백피 추출물 처리 모두 인터류킨-6 생성량이 유의하게 감소하였다. 하지만 상백피 추출물 처리군의 인터류킨-6 생성량은 약 75 pg/mL 감소한 반면, 상지 추출물 처리군에서는 약 450 pg/mL 감소한 것으로 확인되어 상지 추출물의 염증성 사이토카인 억제 능력이 통계적 유의성을 가지며 훨씬 우수한 것으로 확인되었다(p<0.05). 종양괴사인자-α 역시 지방질다당류군에서 생성량이 대조군에 비해 유의적으로 증가(p<0.
후속연구
종양괴사인자-α는 IκB kinase (IKK)와 nuclear factor kappa B (NF-κB)의 신호전달을 받아 발현된다(20). 따라서 종양괴사인자-α의 발현을 조절하는 상위 조절분자의 활성 및 단백질 발현정도를 확인하는 연구가 필요할 것으로 사료된다.
특히 상백피, 상지 추출물을 비교한 결과, 상지 추출물이 상백피 추출물보다 프로스타글란딘 E2, 인터류킨-6 생성량과 COX-2, iNOS mRNA 발현량을 유의적으로 감소시키는 것으로 나타나 상지 추출물이 항염증 효과가 더 좋은 것으로 나타났다. 본 연구는 상백피 및 상지 추출물의 항염증 활성을 mRNA 수준에서만 진행하였는데 다음 연구에서는 관련 효소 활성도 및 단백질 수준에서의 변화를 제시하는 연구가 진행되어야 할 것으로 사료된다. 추후 상백피, 상지 추출물에 함유된 성분들을 분석하여 해당 성분들의 차이에 관한 연구가 더 진행되어야 할 것으로 보인다.
추후 상백피, 상지 추출물에 함유된 성분들을 분석하여 해당 성분들의 차이에 관한 연구가 더 진행되어야 할 것으로 보인다. 이로써 상지 추출물이 효과적인 항염증 효과를 보이는 건강기능식품 소재로서 개발 가능성을 가지고 있으며, 향후 연구는 상지 추출물의 염증완화 메커니즘을 통한 관련 질환에 효과가 있는지 정확한 작용메커니즘 확인 등의 분석실험이 필요할 것으로 생각된다.
본 연구는 상백피 및 상지 추출물의 항염증 활성을 mRNA 수준에서만 진행하였는데 다음 연구에서는 관련 효소 활성도 및 단백질 수준에서의 변화를 제시하는 연구가 진행되어야 할 것으로 사료된다. 추후 상백피, 상지 추출물에 함유된 성분들을 분석하여 해당 성분들의 차이에 관한 연구가 더 진행되어야 할 것으로 보인다. 이로써 상지 추출물이 효과적인 항염증 효과를 보이는 건강기능식품 소재로서 개발 가능성을 가지고 있으며, 향후 연구는 상지 추출물의 염증완화 메커니즘을 통한 관련 질환에 효과가 있는지 정확한 작용메커니즘 확인 등의 분석실험이 필요할 것으로 생각된다.
본 연구에서 확인한 결과로 상백피, 상지 추출물 모두 염증 매개인자 발현 억제를 통해 항염증 효과를 가짐을 알 수 있었으며, 상지 추출물이 상백피 추출물 보다 염증 완화 효과가 강한 것으로 나타났다. 향후에는 상백피 및 상지 추출물의 주요 활성 성분들의 차이와, 염증완화 메커니즘을 통한 관련 질환에 효과가 있는지 정확한 작용메커니즘 확인 등의 분석실험이 필요할 것으로 생각된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
COX-2와 관련된 반응은?
전염증성 사이토카인들은 iNOS(inducible NO synthase) 발현을 유발하고 산화질소(II) 생산을 일으킬 수 있다. 또한 cyclooxygenase-2 (COX-2)의 발현은 세포손상, 고통, 부종 및 열, 신생혈관 형성 및 전이 같은 종양생성과 깊은 관련이 있다(8-10). 따라서 이러한 염증 매개 인자의 효율적인 억제가 항염증 활성을 가진 식품소재 개발의 중요한 전략으로 보인다.
뽕나무의 어린 가지인 상지의 외형적 특징은?
5-1 cm이다. 외면은 노르스름한 회색 또는 회갈색이고 여러 개의 연한 갈색의 작은 점 모양의 피공 및 가는 세로무늬가 있으며 회백색의 반월형 엽흔과 활갈색의 엽아가 보인다(11). 뽕나무에서 기원한 상지에 관해서는 암, 항고혈압, 항염증 및 항당뇨 성분인 옥시레스베라트롤(oxyresveratrol), 레스베라트롤(resveratrol) 및 모라신(moracin) 등이 함유되어 있음을 보고한 바가 있다(15,16).
염증이란?
염증은 물리적인 상처나 미생물에 감염되었을 때 일어나는 정상적인 생체의 방어메커니즘의 일종이며 이 염증작용을 통하여 발병요인을 중화시키거나 제거하고 손상된 조직을 복구시켜 정상적인 구조와 기능을 하게 한다(1). 만성염증은 암, 신경계질환, 대사이상, 심장병 등과 같은 만성 질환과 폭 넓게 연관되어 있고, 이는 산화스트레스와 밀접한 상호작용이 있다(2-4).
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