Elicitor 처리한 주름조개풀(Oplismenus undulatifolius)의 항산화, tyrosinase, elastase, collagenase 및 hyaluronidase 억제 활성 증대 Elevation of anti-oxidative activity and inhibitory activities against tyrosinase, elastase, collagenase and hyaluronidase of Oplismenus undulatifolius by elicitor treatment원문보기
본 연구에서는 생리활성물질유도제인 elicitor를 처리한 주름조개풀의 열수, 에탄올 추출물들의 항산화 효과, tyrosinase, elastase, collagenase 및 HAase 등의 미용관련 생리활성의 변화를 살펴보았다. Elicitor 처리한 주름조개풀 추출물의 DPPH 및 PF 등의 항산화 효과는 elicitor 비처리구인 대조구에 비해 elicitor 처리구가 농도의존적으로 더 높은 항산화 활성을 나타내었다. Elicitor 처리한 주름조개풀 추출물의 미용활성은 elastase 및 collagenase 억제 효과에 의한 주름개선효과와 tyrosinase 저해에 의한 미백효과가 비처리구인 대조구에 비해 상대적으로 매우 높은 효소 억제 효과를 나타내어 elicitor 처리가 주름조개풀추출물의 미백 및 주름개선 효과의 증대에 크게 영향을 미치는 것으로 확인되었으며, 농도의존적인 양상을 나타내었다. 또한 HAase 억제에 의해 유래되는 염증 억제 효과도 비처리구인 대조구에 비해 에탄올 추출물에서 우수한 염증 억제 효과를 나타내었다. Elicitor 처리에 의해 대조구에 비해 처리구에서 생리활성 효소에 대한 억제율이 큰 폭으로 상승하는 효과를 나타내어, elicitor 처리가 유용물질의 산업화라는 전제를 충족시키기 위한 biomass 기법으로 매우 적당하다는 것을 시사해주었다. 따라서 주름조개풀 노지재배 시에 본 연구에서 사용한 elicitor를 처리하면 수확되는 주름조개풀의 단위 무게 당 유용물질의 생산량을 높일 수 있고, 생리할성도 증대시킬 수가 있어 산업화를 위한 고기능성 원료생산에 효율적인 재배기법으로 활용할 수 있을 것이라 판단되었다.
본 연구에서는 생리활성물질유도제인 elicitor를 처리한 주름조개풀의 열수, 에탄올 추출물들의 항산화 효과, tyrosinase, elastase, collagenase 및 HAase 등의 미용관련 생리활성의 변화를 살펴보았다. Elicitor 처리한 주름조개풀 추출물의 DPPH 및 PF 등의 항산화 효과는 elicitor 비처리구인 대조구에 비해 elicitor 처리구가 농도의존적으로 더 높은 항산화 활성을 나타내었다. Elicitor 처리한 주름조개풀 추출물의 미용활성은 elastase 및 collagenase 억제 효과에 의한 주름개선효과와 tyrosinase 저해에 의한 미백효과가 비처리구인 대조구에 비해 상대적으로 매우 높은 효소 억제 효과를 나타내어 elicitor 처리가 주름조개풀추출물의 미백 및 주름개선 효과의 증대에 크게 영향을 미치는 것으로 확인되었으며, 농도의존적인 양상을 나타내었다. 또한 HAase 억제에 의해 유래되는 염증 억제 효과도 비처리구인 대조구에 비해 에탄올 추출물에서 우수한 염증 억제 효과를 나타내었다. Elicitor 처리에 의해 대조구에 비해 처리구에서 생리활성 효소에 대한 억제율이 큰 폭으로 상승하는 효과를 나타내어, elicitor 처리가 유용물질의 산업화라는 전제를 충족시키기 위한 biomass 기법으로 매우 적당하다는 것을 시사해주었다. 따라서 주름조개풀 노지재배 시에 본 연구에서 사용한 elicitor를 처리하면 수확되는 주름조개풀의 단위 무게 당 유용물질의 생산량을 높일 수 있고, 생리할성도 증대시킬 수가 있어 산업화를 위한 고기능성 원료생산에 효율적인 재배기법으로 활용할 수 있을 것이라 판단되었다.
This study was designed to assess the change of the antioxidative and biological enzyme activities [tyrosinase, elastase, collagenase, and hyaluronidase (HAase)] of extracts from elicitor-treated Oplismenus undulatifolius. Elicitor-treated O. undulatifolius showed higher total phenolic content than ...
This study was designed to assess the change of the antioxidative and biological enzyme activities [tyrosinase, elastase, collagenase, and hyaluronidase (HAase)] of extracts from elicitor-treated Oplismenus undulatifolius. Elicitor-treated O. undulatifolius showed higher total phenolic content than the non-treated extract. As a result of comparing the anti-oxidant activity of elicitor-treated O. undulatifolius extract and non-treated extract, the elicitor-treated group showed high activity. Elicitor-treated O. undulatifolius showed higher elastase and collagenase inhibitory activities as anti-wrinkle effect, tyrosinase inhibitory activity as whitening effect, and anti-inflammation effect to induced as HAase inhibition than the non-treated extract. Therefore, elicitor-treatment during O. undulatifolius cultivation in outdoors will elevate total phenolics content in the plant and elevate of various bioactivities, which will yield high quality for industrialization.
This study was designed to assess the change of the antioxidative and biological enzyme activities [tyrosinase, elastase, collagenase, and hyaluronidase (HAase)] of extracts from elicitor-treated Oplismenus undulatifolius. Elicitor-treated O. undulatifolius showed higher total phenolic content than the non-treated extract. As a result of comparing the anti-oxidant activity of elicitor-treated O. undulatifolius extract and non-treated extract, the elicitor-treated group showed high activity. Elicitor-treated O. undulatifolius showed higher elastase and collagenase inhibitory activities as anti-wrinkle effect, tyrosinase inhibitory activity as whitening effect, and anti-inflammation effect to induced as HAase inhibition than the non-treated extract. Therefore, elicitor-treatment during O. undulatifolius cultivation in outdoors will elevate total phenolics content in the plant and elevate of various bioactivities, which will yield high quality for industrialization.
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문제 정의
본 연구에서는 약리성 화합물의 생산성을 높여주는 elicitation 기술 적용 시스템의 적용하여 이에 대한 기술 확립과 주름조개풀 생체 내 이차대사산물의 생산성과 생리활성 효과를 증가시키는 것을 목적으로 한다.
제안 방법
5 mL를 넣고 38 ℃의 water bath에서 5분간 preincubation시킨다. 0.3 M phosphate buffer (pH 5.3)에 녹인 기질 용액(4 mg/mL) 0.5 mL를 첨가하고 다시 45분간 water bath에서 reaction시킨 후 5 mL의 알부민용액을 첨가하여 5분간 반응시키고 600 nm의 파장에서 투과율을 측정하여 대조구의 투과율과 비교하여 계산 하였다.
3 m2)을 기준으로 성장단계 및 평당 주름조개풀의 분포도를 측정하여 1평당 elicitor 처리 살포량을 결정하였다. Elicitor 살포량은 처리그룹별 1 mg/mL (group A), 3 mg/mL (group B), 및 5 mg/mL (group C)의 농도로 설정하여 1평당 1 L (1, 3, 5 g/L)를 기준으로 계산하였다. 주름조개풀의 평당 분포도는 1차, 2차, 3차 처리 시기별로 1평당 분포도를 측정하여 60, 80, 100%로 설정한 후 elicitor를 제조하였으며, 일정기간에 따라 총 3회에 걸쳐 elicitor 용액을 제조한 후 분무기를 사용하여 직접 잎에 분무하였다.
Elicitor 처리군과 무처리군 추출물의 유용성분 함량의 변화를 비교하기 위해 안전하면서 유용성분을 가장 많이 추출할 수 있는 용매로 열수와 에탄올을 선정하여, 대조군과 elicitor 1 mg/ mL 처리군을 A그룹, 3 mg/mL 처리군을 B그룹, 5 mg/mL 처리군을 C그룹으로 나누어 각 처리군별 분말 sample 1 g을 물과 70% 에탄올 100 mL에 침지시켜 24시간 동안 교반 추출하여 분석용 추출물을 제조하였다. 주름조개풀 열수 추출물의 total phenolics 함량은 Fig.
Elicitor 처리에 의해 stress를 받은 그룹이 식물 체내에 존재하는 phytochemical 중 total phenolics 생산에 영향을 미칠 것으로 예상되어 elicitor 처리군과 무처리군 추출물의 phenolics profile을 HPLC로 분석을 통해 확인하였다. Elicitor 처리에 따른 주름조개풀 추출물 내 유용성분의 변화를 비교하기 위해 UV spectrophotometer를 이용하여 200 nm에서 400 nm까지 흡수선량을 측정하였으며, 4구간 모두 동일하게 가장 높은 측정값을 나타낸 230 nm를 최적 흡수파장으로 선정하여 Table 1에서의 조건에 따라 HPLC를 이용하여 분석하였다.
Elicitor 처리에 의해 stress를 받은 그룹이 식물 체내에 존재하는 phytochemical 중 total phenolics 생산에 영향을 미칠 것으로 예상되어 elicitor 처리군과 무처리군 추출물의 phenolics profile을 HPLC로 분석을 통해 확인하였다. Elicitor 처리에 따른 주름조개풀 추출물 내 유용성분의 변화를 비교하기 위해 UV spectrophotometer를 이용하여 200 nm에서 400 nm까지 흡수선량을 측정하였으며, 4구간 모두 동일하게 가장 높은 측정값을 나타낸 230 nm를 최적 흡수파장으로 선정하여 Table 1에서의 조건에 따라 HPLC를 이용하여 분석하였다.
Elicitor의 제조는 Cho 등의 방법[21]에 의하여 생리활성물질유도제(elicitor) 분말을 제조하였다. Elicitor의 적용은 노지에서 주름조개풀의 어린잎이 자라기 시작하는 4월 하순경부터 잎이 다 자라는 6-7월 하순경까지 1평(3.3 m2)을 기준으로 성장단계 및 평당 주름조개풀의 분포도를 측정하여 1평당 elicitor 처리 살포량을 결정하였다. Elicitor 살포량은 처리그룹별 1 mg/mL (group A), 3 mg/mL (group B), 및 5 mg/mL (group C)의 농도로 설정하여 1평당 1 L (1, 3, 5 g/L)를 기준으로 계산하였다.
현재 elicitation 기술은 식물조직세포(callus)의 기내 배양단계에서 사용되고 있으나, 노지재배에서는 적용 예가 거의 없는 실정이므로, 농가가 재배하는 작물이 아닌 야생초로서 정확한 재배방법이 모색되어 있지 않은 실정이다. 그러므로 본 연구를 진행하기 위해 경북 봉화군 청량산 일대 야생에 분포하는 주름조개풀을 경북대학교 생물학과에서 품종 확인을 한 후, 현지에서 직접 채집하여 경북대학교 농업생명과학대학 부속실험실습장 내 비닐하우스 M2 실험장에 이식하여 대량 증식 재배를 하며 노지재배 상태에서 elicitor 처리를 하였다.
앞의 결과에서 elicitor 처리에 의해 생성되는 phenolic compounds의 농도 증가와 phenolics profile의 변화가 확인되었으나, 이러한 phenolic의 변화가 생리활성에 미치는 영향을 살펴보기 위해 항산화를 포함한 각종 생리활성 효소의 활성을 측정하였다.
열수 추출물의 제조는 시료 1g에 증류수 200 mL를 넣고 가열하여 액이 100 mL이 되었을 때 냉각하였으며, 에탄올 추출물은 1g의 시료에 70% 에탄올 100 mL를 가하여 homogeniger로 20,000 rpm에서 1분간 균질화하였다. 열수, 에탄올 추출물 모두 12시간 이상 교반 추출하고 추출액은 whatman No. 1 filter paper로 여과하였다.
Elicitor 살포량은 처리그룹별 1 mg/mL (group A), 3 mg/mL (group B), 및 5 mg/mL (group C)의 농도로 설정하여 1평당 1 L (1, 3, 5 g/L)를 기준으로 계산하였다. 주름조개풀의 평당 분포도는 1차, 2차, 3차 처리 시기별로 1평당 분포도를 측정하여 60, 80, 100%로 설정한 후 elicitor를 제조하였으며, 일정기간에 따라 총 3회에 걸쳐 elicitor 용액을 제조한 후 분무기를 사용하여 직접 잎에 분무하였다.
주름조개풀 추출물 1 mL에 60 μM DPPH 3 mL를 첨가하여 시약이 섞일 수 있게 vortex한 후 15분 동안 실온에서 시약을 반응시켰다. 측정은 517 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였으며, 추출물의 흡광도와 대조구의 흡광도 차이를 이용하여 계산하였다. β-Carotene의 산화 정도에 따라 지용성 항산화 활성을 측정하는 PF는 Andarwulan과 Shetty의 방법[25]에 준하여 측정하였다.
이 후 vortex하여 실온에 5분간 반응시킨 후 발색 시약인 Na2CO3 1 mL를 섞어주고 암실에서 1시간 반응시켰다. 측정은 725 nm의 파장에서 흡광도(Optical density, OD)를 측정하였으며, total phenolic compounds 함량은 gallic acid를 이용한 표준곡선을 이용하여 정량하였다.
데이터처리
모든 실험결과는 평균 ± 표준편차(mean ± standard deviation)로 표현하였다.
통계 분석은 최소 6개의 기술 복제물에 대한 실험을 위해 SPSS 25 (Statistical Package for Social Science, Chicago, IL, USA)의 Duncan’s multiple range test one way ANOVA를 사용하여 수행되었다.
이론/모형
β-Carotene의 산화 정도에 따라 지용성 항산화 활성을 측정하는 PF는 Andarwulan과 Shetty의 방법[25]에 준하여 측정하였다.
Elastin과 마찬가지로 피부 구조를 이루고 있는 collagen을 분해 하여 주름을 유발하는 효소인 collagenase 저해 효과를 측정하기 위해 Wunsch와 Heidrich의 방법[28]에 준하여 실험하였다. 0.
Elicitor의 제조는 Cho 등의 방법[21]에 의하여 생리활성물질유도제(elicitor) 분말을 제조하였다. Elicitor의 적용은 노지에서 주름조개풀의 어린잎이 자라기 시작하는 4월 하순경부터 잎이 다 자라는 6-7월 하순경까지 1평(3.
Hyaluronic acid (HA)의 분해를 촉매하는 효소인 HAase 저해 효과를 측정하기 위해 Dorfman와 Ott의 방법[29]에 준하여 실험하였다. 주름조개풀 추출물 0.
라디칼의 생성 여부에 따라 보라색으로 변하는 수용성 항산화 활성 중 DPPH radical 소거능은 Blois의 방법[24]에 준하여 측정하였다. 주름조개풀 추출물 1 mL에 60 μM DPPH 3 mL를 첨가하여 시약이 섞일 수 있게 vortex한 후 15분 동안 실온에서 시약을 반응시켰다.
주름조개풀 추출물의 tyrosinase 저해 효과 측정을 하기 위해 Vincent와 Hearing의 방법[26]에 준하여 실험하였다. 주름조개풀 추출물 0.
추출물에 함유된 total phenolic compounds의 함량을 측정하기 위해 Folin과 Denis[23]의 방법에 준하여 주름조개풀 추출물 1 mL, 동량의 95% 에탄올 1 mL와 5 mL의 증류수를 첨가한 후 2 N 농도의 Folin-ciocalteu reagent를 2배 희석하여 0.5 mL를 첨가하였다. 이 후 vortex하여 실온에 5분간 반응시킨 후 발색 시약인 Na2CO3 1 mL를 섞어주고 암실에서 1시간 반응시켰다.
피부 탄력을 유지하는 elastin을 분해하여 주름 형성에 영향을 미치는 효소인 elastase 저해 효과를 측정하기 위해 Kraunsoe 등의 방법[27]에 준하여 실험하였다. 주름조개풀 추출물 0.
성능/효과
Elicitor 처리한 주름조개풀 추출물의 elastase 및 collagenase 억제 효과는 Figs. 5A-B에서와 같이 비처리구인 대조구에 비해 elicitor 처리가 주름조개풀 추출물의 주름개선 효과의 증대에 매우 큰 영향을 미치는 것으로 확인되었다. Elicitor의 처리에 의해 열수 추출물 보다 에탄올 추출물에서 효소활성 억제 효과가 상대적으로 더 높게 나타나는 것으로 확인되었으며, elicitor의 처리 농도가 높아질수록 elastase와 collagenase의 억제 효과가 처리농도 의존적으로 가파르게 증가하는 것이 관찰되어 elicitor의 처리농도를 높일수록 주름개선 효과가 우수한 기능성 화장품 원료의 생산이 가능할 것으로 판단되었다.
Elicitor 처리한 주름조개풀 추출물의 염증 억제 효과는 Fig. 6에서와 같이 비처리구인 대조구에 비해 열수 추출물에서는 효소활성이 관찰되지 않았으나, 에탄올 추출물에서는 elicitor를 처리에 의해 농도 의존적으로 우수한 염증 억제 효과를 나타내어 elicitor 처리가 유용물질의 산업화라는 전제를 충족시키기 위한 biomass 기법으로 매우 적당하다는 것을 시사해주었다.
5A-B에서와 같이 비처리구인 대조구에 비해 elicitor 처리가 주름조개풀 추출물의 주름개선 효과의 증대에 매우 큰 영향을 미치는 것으로 확인되었다. Elicitor의 처리에 의해 열수 추출물 보다 에탄올 추출물에서 효소활성 억제 효과가 상대적으로 더 높게 나타나는 것으로 확인되었으며, elicitor의 처리 농도가 높아질수록 elastase와 collagenase의 억제 효과가 처리농도 의존적으로 가파르게 증가하는 것이 관찰되어 elicitor의 처리농도를 높일수록 주름개선 효과가 우수한 기능성 화장품 원료의 생산이 가능할 것으로 판단되었다.
그 결과 Fig. 2에서와 같이 열수 추출물에서는 무처리군인 대조군의 4, 5, 6 min대의 1, 2, 3, 4번 pick와 elicitor 처리군의 pick가 농도에 따라 큰 변화가 없는 것을 확인하였다. 반면 8 min대의 5번 pick의 경우, 무처리군인 대조군보다 elicitor 처리 군에서 증가하는 intensity를 나타내었다.
농도별로 elicitor를 처리하여 제조한 주름조개풀 추출물의 tyrosinase 억제 효과를 측정한결과 Fig. 4에서와 같이 대조군에 비해 elicitor 처리군 A, B, C그룹에서 더 효과적인 효소억제 효능을 나타내어 멜라닌 형성 효소를 억제하는 것을 확인하였다.
위의 결과를 통해 주름조개풀의 생육 시 elicitor 처리에 의해 phytochemical 물질인 phenolic 생성량이 증가하며, elicitor의 처리농도에 따라 phenolics profile도 변화되는 것을 확인하였다. 따라서 elicitor 처리한 주름조개풀의 각 추출물들이 다양한 생리활성에도 영향을 미칠 것으로 예상되었다. Elicitor 처리에 의해 변화하는 phenolic profile의 변화에 대한 연구는 현재 진행되고 있으므로 향후 진행될 연구보고에 인용될 수 있을 것으로 기대된다.
3에서와 같았다. 먼저 수용성 항산화력의 지표인 DPPH radical 저해 효과의 경우, 생리활성물질유도제(elicitor) 처리 농도에 따라 Fig. 3A에서와 같이 저해율이 증가하는 양상을 나타내었고, 지용성 항산화 효능의 지표인 PF 효과 역시 Fig. 3B에서와 같이 elicitor 처리에 따라 농도 의존적으로 PF값이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이상의 결과에 따라 주름조개풀 재배 시 elicitor 처리로 생성된 새로운 phenolic 성분들이 항산화력을 증가시키는 것으로 확인되었으며, 이들이 생리활성에 관여하는 것으로 추측할 수 있었다.
반면 8 min대의 5번 pick의 경우, 무처리군인 대조군보다 elicitor 처리 군에서 증가하는 intensity를 나타내었다. 반면 에탄올 추출물에서는 대조군의 4, 5 min대의 1, 2, 3번 pick와 elicitor 처리군의 pick가 농도에 따라 큰 변화가 없는 것을 확인되었으나, 6 min대의 4번 pick의 경우, 대조군보다 elicitor 처리군의 농도가 증가할수록 pick가 감소하는 intensity를 나타내었으며, 5번 pick는 elicitor 처리군에 의해 높은 intensity를 나타내었다. 위의 결과를 통해 주름조개풀의 생육 시 elicitor 처리에 의해 phytochemical 물질인 phenolic 생성량이 증가하며, elicitor의 처리농도에 따라 phenolics profile도 변화되는 것을 확인하였다.
반면 에탄올 추출물에서는 대조군의 4, 5 min대의 1, 2, 3번 pick와 elicitor 처리군의 pick가 농도에 따라 큰 변화가 없는 것을 확인되었으나, 6 min대의 4번 pick의 경우, 대조군보다 elicitor 처리군의 농도가 증가할수록 pick가 감소하는 intensity를 나타내었으며, 5번 pick는 elicitor 처리군에 의해 높은 intensity를 나타내었다. 위의 결과를 통해 주름조개풀의 생육 시 elicitor 처리에 의해 phytochemical 물질인 phenolic 생성량이 증가하며, elicitor의 처리농도에 따라 phenolics profile도 변화되는 것을 확인하였다. 따라서 elicitor 처리한 주름조개풀의 각 추출물들이 다양한 생리활성에도 영향을 미칠 것으로 예상되었다.
위의 결과에 따라 elicitor를 처리하여 수확한 주름조개풀의 단위 무게당 활성물질인 phenolic compounds의 함유량 또는 생산량을 높이고, 생리활성에 영향을 미치는 효소의 억제를 통해 천연물 기반의 유용물질 증폭, 효율적인 원료 생산, 및 재배기법의 진화에 활용할 수 있다고 판단되었다.
3B에서와 같이 elicitor 처리에 따라 농도 의존적으로 PF값이 증가하는 것을 확인할 수 있었다. 이상의 결과에 따라 주름조개풀 재배 시 elicitor 처리로 생성된 새로운 phenolic 성분들이 항산화력을 증가시키는 것으로 확인되었으며, 이들이 생리활성에 관여하는 것으로 추측할 수 있었다.
주름조개풀 열수 추출물의 total phenolics 함량은 Fig. 1에서와 같이, 대조군, A, B, C그룹 순으로 9.24±0.12, 7.97±0.14, 12.06±0.04, 12.52±0.23 mg/g으로 elicitor를 3 mg 이상 처리한 group에서 phenol량의 증가가 관찰되었으며, 에탄올 추출물의 total phenolics 함량은 대조군, A, B, C그룹 순으로 7.35±0.15, 7.64±0.07, 10.80±0.36 및 18.22±0.42 mg/g으로 elicitor가 처리되는 농도가 높아질수록 elicitor 처리에 의해 대조군보다 높은 함량을 나타내는 것을 확인하였다.
42 mg/g으로 elicitor가 처리되는 농도가 높아질수록 elicitor 처리에 의해 대조군보다 높은 함량을 나타내는 것을 확인하였다. 특히 에탄올 추출물에서 phenol성 물질의 함량이 열수 추출물에서 보다 더 높아지는 경향을 나타내는 것은 Lee 등[33]의 보고에 따라 생리활성에 관여하는 에탄올 추출물에서 phenol성 물질이 더 높아진다는 사실이 기능성 효과의 증대를 기대할 수 있다는 의미에서는 더 효과적인 것으로 판단되었다.
후속연구
따라서 elicitor 처리한 주름조개풀의 각 추출물들이 다양한 생리활성에도 영향을 미칠 것으로 예상되었다. Elicitor 처리에 의해 변화하는 phenolic profile의 변화에 대한 연구는 현재 진행되고 있으므로 향후 진행될 연구보고에 인용될 수 있을 것으로 기대된다.
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