[국내논문]Chinese Hamster Lung Cell을 이용한 in vitro 소핵시험의 세포질 최적화 연구 Study on Optimization of Cytoplasm Conditions for In Vitro Micronucleus Test Using Chinese Hamster Lung Cells원문보기
In vitro 소핵시험(vitMNT)은 유전독성의 유망한 대체시험법 중 하나로, OECD에서 TG로 채택되어 화학물질의 등록에 사용되고 있다. 본 시험에서는 CHL cell을 사용한 vitMN test에서 소핵을 판별하기 위한 최적화된 세포질 조건을 찾고자 하였으며, 양성대조물질로 MMC와 Col을 사용하고 세포 염색을 위해 giemza 용액을 사용하였다. 시험결과, 세포현탁을 위해 사용되는 고정액의 acetic acid의 농도는 1%로 하는 것이 band의 두께와 세포질의 퍼짐성 측면에서 적당하였다. 또한 세포의 깨짐을 최소화하는 최종 고정액의 적하시간은 현탁 후 1~4시간이었다. 이러한 결과는 vitMNT에서 소핵관찰의 신속성, 용이성 및 정확성을 확보하는데 도움이 될 것이다.
In vitro 소핵시험(vitMNT)은 유전독성의 유망한 대체시험법 중 하나로, OECD에서 TG로 채택되어 화학물질의 등록에 사용되고 있다. 본 시험에서는 CHL cell을 사용한 vitMN test에서 소핵을 판별하기 위한 최적화된 세포질 조건을 찾고자 하였으며, 양성대조물질로 MMC와 Col을 사용하고 세포 염색을 위해 giemza 용액을 사용하였다. 시험결과, 세포현탁을 위해 사용되는 고정액의 acetic acid의 농도는 1%로 하는 것이 band의 두께와 세포질의 퍼짐성 측면에서 적당하였다. 또한 세포의 깨짐을 최소화하는 최종 고정액의 적하시간은 현탁 후 1~4시간이었다. 이러한 결과는 vitMNT에서 소핵관찰의 신속성, 용이성 및 정확성을 확보하는데 도움이 될 것이다.
BACKGROUND: in vitro micronucleus test (vitMNT) is one of the promising alternative testing methods in genotoxicity test and was adopted as OECD test guideline for chemical registration. This study was conducted to optimize the cytoplasm conditions in vitMNT using Chinese hamster lung (CHL) cell. ME...
BACKGROUND: in vitro micronucleus test (vitMNT) is one of the promising alternative testing methods in genotoxicity test and was adopted as OECD test guideline for chemical registration. This study was conducted to optimize the cytoplasm conditions in vitMNT using Chinese hamster lung (CHL) cell. METHODS AND RESULTS: In this study cytokinesis-block micronucleus test was conducted. Mitomycin C and colchicine were used as positive control chemicals and were treated for three hours (short time) or twenty-four hours (long time). Giemsa solution was used for cell staining. For optimization of vitMNT, the final fixative was prepared as five concentrations (0%, 1%, 3%, 5%, and 25%) of acetic acid in methanol, and treatment times of the final fixative were varied under four conditions (immediately, one hour, four hours, and one day). CONCLUSION: Acetic acid at 1% in methanol as the final fixative was most adequate to preserve the cytoplasm around the nucleus in the interphase cells. Also, fixative treatment time of cell suspension for one to four hours may minimize the cell rupture. These results can be helpful for getting an accurate result promptly due to clear visual distinction to score micronucleus in vitMNT using giemsa solution.
BACKGROUND: in vitro micronucleus test (vitMNT) is one of the promising alternative testing methods in genotoxicity test and was adopted as OECD test guideline for chemical registration. This study was conducted to optimize the cytoplasm conditions in vitMNT using Chinese hamster lung (CHL) cell. METHODS AND RESULTS: In this study cytokinesis-block micronucleus test was conducted. Mitomycin C and colchicine were used as positive control chemicals and were treated for three hours (short time) or twenty-four hours (long time). Giemsa solution was used for cell staining. For optimization of vitMNT, the final fixative was prepared as five concentrations (0%, 1%, 3%, 5%, and 25%) of acetic acid in methanol, and treatment times of the final fixative were varied under four conditions (immediately, one hour, four hours, and one day). CONCLUSION: Acetic acid at 1% in methanol as the final fixative was most adequate to preserve the cytoplasm around the nucleus in the interphase cells. Also, fixative treatment time of cell suspension for one to four hours may minimize the cell rupture. These results can be helpful for getting an accurate result promptly due to clear visual distinction to score micronucleus in vitMNT using giemsa solution.
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문제 정의
더욱이, 소핵은 주요 핵과 독립적인 작은 개체이기 때문에, 부적절한 고정 또는 퍼짐성 절차가 적용되면 쉽게 잃어버릴 수 있다. 본 시험에서는 OECD 시험법 가이드라인 487, in vitro mammalian cell micronucleus test에서 의거하여 Chinese hamster lung(CHL) 세포를 사용하여 CBMN 조건에서 vitMNT 중소핵 계수 단계의 cytoplasm과 그 band의 판별이 용이한 최상의 조건을 선정하고자 하였다. 양성대조물질인 mitomycin C(MMC)와 colchicine (Col)을 이용하여1) 최종 현탁액인 3차 고정액인 메탄올 중 아세트산 농도 5조건(0%, 1%, 3%, 5%, 25%), 2) 최종 고정액의 처리시간 차이(즉시, 1시간, 4시간, 1일 경과)별로 현탁액을 슬라이드로 적하한 후 육안으로 소핵관찰이 용이한지 살펴보기 위하여 현미경을 이용해 세포질의 퍼짐성과 세포의 터짐성(cell rupture)을 관찰하였다.
제안 방법
본 시험에서는 OECD 시험법 가이드라인 487, in vitro mammalian cell micronucleus test에서 의거하여 Chinese hamster lung(CHL) 세포를 사용하여 CBMN 조건에서 vitMNT 중소핵 계수 단계의 cytoplasm과 그 band의 판별이 용이한 최상의 조건을 선정하고자 하였다. 양성대조물질인 mitomycin C(MMC)와 colchicine (Col)을 이용하여1) 최종 현탁액인 3차 고정액인 메탄올 중 아세트산 농도 5조건(0%, 1%, 3%, 5%, 25%), 2) 최종 고정액의 처리시간 차이(즉시, 1시간, 4시간, 1일 경과)별로 현탁액을 슬라이드로 적하한 후 육안으로 소핵관찰이 용이한지 살펴보기 위하여 현미경을 이용해 세포질의 퍼짐성과 세포의 터짐성(cell rupture)을 관찰하였다.
본 시험에서는 세포질의 최적화 조건을 선정하고자 3차 고정액인 최종 고정액을 메탄올 중 acetic acid 농도가 5가지 농도(0%, 1%, 3%, 5%, 25%)가 되도록 조제하여 현탁하였으며, 또한 최종 고정액의 처리시간 차이 별로 4가지 조건(즉시, 1시간, 4시간, 1일 경과)으로 달리하였다.
소핵의 판독은 Fenech (2006)이 제시한 기준에 따라 판정하였다. Cyto B을 처리하지 않은 시험에서는 각 농도군당 2,000개의 단핵세포(mononucleated cell)로부터 소핵을 가진 세포(micronucleated cell, MNC)를 계수하지만, 본 시험에서는 Cyto B을 처리하였기에 단핵세포(mononucleatedcell), 이핵세포(binucleatedcell), 다핵세포(multinucleatedcell)의 합계가 500개가 될 때까지 세포를 계수하고, 이핵세포가 1000개가 될 때까지 소핵을 계수하여 기록하였다. 결과해석을 위해 RI (Replicative Index)와 CBPI (CytokinesisBlock Proliferation index)를 산출하여 평가하였다.
vitMNT는 해당 시험조건에서 양성대조물질의 소핵유발률이 음성대조군에 비해 유의적으로 높은 수준으로 historical range에 드는지에 대한 신뢰성이 검증되어야 한다. 따라서 CHL 세포에 음성대조군과 양성대조군을 단기간 및 장기간 처리한 vitMN시험에서 세포질의 최적화 조건으로 제안된 시험조건인 1) 1% acetic acid의 최종 고정액 사용, 2) 고정액처리시간 1시간으로 수행했을 때의 소핵의 발생률을 조사하였다(Table 1).
In vitro 소핵시험(vitMNT)은 유전독성의 유망한 대체시험법 중 하나로, OECD에서 TG로 채택되어 화학물질의 등록에 사용되고 있다. 본 시험에서는 CHL cell을 사용한 vitMN test에서 소핵을 판별하기 위한 최적화된 세포질 조건을 찾고자 하였으며, 양성대조물질로 MMC와 Col을 사용하고 세포 염색을 위해 giemza 용액을 사용하였다. 시험결과, 세포현탁을 위해 사용되는 고정액의 acetic acid의 농도는 1%로 하는 것이 band의 두께와 세포질의 퍼짐성 측면에서 적당하였다.
대상 데이터
양성대조물질로는 염색체의 구조적 이상을 유발하는 MMC와 수적이상을 유발하는 Col은 Sigma Aldrich (St Louis, MO, USA)에서 구입하였으며, 본 실험에서 실험수행의 적합성 검증을 위해 사용되었다. MMC는 멸균 증류수에, Col은 dimethyl sulphoxide (DMSO)에 용해하여 사용하였으며, 음성대조물질은 멸균 증류수를 사용하였다.
세포는 37℃, 5% CO2조건에서 2~3일 간격으로 계대배양하였으며, 세포의 doubling time은 25시간이었다. 액틴의 polymerizationatin 저해제로 사용되는 cytochalasinB (cyto B)는 Sigma Aldrich(St Louis, MO, USA)에서 구입하여 사용하였다.
실험에서 사용된 세포주는 CHL cell로 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)로 부터 구매하였으며, 세포는 10% Fetal Bovine Serum, 1% penicillinstreptomycin, 1% L-glutamine가 포함된 MEM (Minimum essential medium)를 모두 Gibco/Invitrogen (Carlsbad, CA)에서 구입하여 배양하는데 사용하였다. 세포는 37℃, 5% CO2조건에서 2~3일 간격으로 계대배양하였으며, 세포의 doubling time은 25시간이었다.
데이터처리
Cyto B을 처리하지 않은 시험에서는 각 농도군당 2,000개의 단핵세포(mononucleated cell)로부터 소핵을 가진 세포(micronucleated cell, MNC)를 계수하지만, 본 시험에서는 Cyto B을 처리하였기에 단핵세포(mononucleatedcell), 이핵세포(binucleatedcell), 다핵세포(multinucleatedcell)의 합계가 500개가 될 때까지 세포를 계수하고, 이핵세포가 1000개가 될 때까지 소핵을 계수하여 기록하였다. 결과해석을 위해 RI (Replicative Index)와 CBPI (CytokinesisBlock Proliferation index)를 산출하여 평가하였다.
통계처리 및 판정은 SPSS(Statistical Package for the Social Sciences, version 18.0)를 이용하였으며, 시험조건 군별 검증을 위해서 one-way ANOVA (analysis of variance)를 실시하고 유의수준 0.05에서 Duncan test로 유의성을 검증하였다. 판정기준은 음성대조군에 비해 3배 이상의 소핵형성과 통계적인 유의성을 보일 때 양성으로 판정하고 계수하였다(Miller et al.
이론/모형
시험은 OECD TG 487의 vitMNT (OECD, 2016)을 근거로 하였으며, cyto B를 첨가한 CBMN 시험으로 진행하였다. 세포 수는 1×105 cells/plate로 물질처리시간은 3시간(단시간 노출)과 24시간(장기간노출)으로 하였으며, 사용된 cyto B의 농도는 3 μg/ml이다.
소핵의 판독은 Fenech (2006)이 제시한 기준에 따라 판정하였다. Cyto B을 처리하지 않은 시험에서는 각 농도군당 2,000개의 단핵세포(mononucleated cell)로부터 소핵을 가진 세포(micronucleated cell, MNC)를 계수하지만, 본 시험에서는 Cyto B을 처리하였기에 단핵세포(mononucleatedcell), 이핵세포(binucleatedcell), 다핵세포(multinucleatedcell)의 합계가 500개가 될 때까지 세포를 계수하고, 이핵세포가 1000개가 될 때까지 소핵을 계수하여 기록하였다.
성능/효과
1A)와 Col (Fig 1B) 모두 cell의 세포질이 명확하게 구분되지 않았다. 또한 아세트산을 포함하지 않은 고정액 사용군에서는 세포질이 좁고 어두워서 이핵에서 소핵을 계수하기 어려웠지만 아세트산이 1%와 3%인 고정액 사용군에서 세포질이 뚜렷하게 보였고 band가 적절하여 소핵을 관찰하기에 효과적이었다.
최종 고정액의 처리시간 차이에 따른 세포질 결과를 살펴보면, 적하시간이 1일이 경과한 경우 세포질이 거의 사라져서 보이지 않았으며, 4시간 경과 후 적하한 군에서는 세포질이 매우 흐리게 나타났다. 따라서 세포를 현탁 시킨 후 4시간 이전에 적하하는 것이 좋음을 알 수 있다.
MMC과 Col을 단시간 처리 시 소핵발생률은 각각 4.0%과 4.3%였으며, 장기간 처리 시 각각 4.1%과 9.2%로 나타났으며, 이는 음성대조군에 비해 유의적으로 증가한 경향을 보였다. 또한 Cyto B 처리했을 때 시험의 타당성을 확인하는 RI는 음성대조군 대비 양성대조군의 500개 이상의 단핵, 이핵, 다핵세포의 수로부터 산출하게 되는데, 본 시험에서 양성대조물질의 단기간 및 장기간 처리한 군에서 67~82%로 나타내어, RI 값의 감소 경향이 일관성을 나타내어 본 시험에서 사용된 방법의 신뢰도가 높음을 알 수 있었다.
2%로 나타났으며, 이는 음성대조군에 비해 유의적으로 증가한 경향을 보였다. 또한 Cyto B 처리했을 때 시험의 타당성을 확인하는 RI는 음성대조군 대비 양성대조군의 500개 이상의 단핵, 이핵, 다핵세포의 수로부터 산출하게 되는데, 본 시험에서 양성대조물질의 단기간 및 장기간 처리한 군에서 67~82%로 나타내어, RI 값의 감소 경향이 일관성을 나타내어 본 시험에서 사용된 방법의 신뢰도가 높음을 알 수 있었다.
이상의 결과를 종합하여 볼 때, vitMNT의 소핵 계수를 위한 신속성 및 용이성, 정확성을 확보하기 위해서는 고정액에 포함된 acetic acid의 함량은 1%로, 고정액 처리시간을 1시간에서 4시간 이내로 하는 것이 가장 적절할 것으로 생각된다.
본 시험에서는 CHL cell을 사용한 vitMN test에서 소핵을 판별하기 위한 최적화된 세포질 조건을 찾고자 하였으며, 양성대조물질로 MMC와 Col을 사용하고 세포 염색을 위해 giemza 용액을 사용하였다. 시험결과, 세포현탁을 위해 사용되는 고정액의 acetic acid의 농도는 1%로 하는 것이 band의 두께와 세포질의 퍼짐성 측면에서 적당하였다. 또한 세포의 깨짐을 최소화하는 최종 고정액의 적하시간은 현탁 후 1~4시간이었다.
3%로 터짐성이 유의적으로 감소하였으나 acetic acid의 농도가 3%인 경우 유의적인 감소는 나타나지 않았다. MMC를 장시간 처리한 경우 고정액 중 acetic acid의 농도가 0%와 3%인 군에서 고정액 처리시간이 증가할수록 세포의 터짐성은 증가하였으나, 1% acetic acid을 함유한 고정액을 처리한 군에서는 고정액 처리 후 즉시 적하한 군(22.4개)에 비해 고정액 처리를 1시간, 4시간, 1일 처리한 경우 터짐성이 각각 14.2개, 16.3개, 15.4개로 즉시 적하한 군에 비해 터짐성이 63.4%, 72.8%, 68.8%로 유의적으로 감소하는 경향을 보였다. 즉 MMC와 Col의 2개의 양성대조물질을 단시간 처리한 경우 3% acetic acid를 함유한 고정액을 처리한 군에서 고정액을 즉시 처리한 군에 비해 1시간 이상 처리한 군에서 세포의 터짐성이 감소하였다.
후속연구
또한 세포의 깨짐을 최소화하는 최종 고정액의 적하시간은 현탁 후 1~4시간이었다. 이러한 결과는 vitMNT에서 소핵관찰의 신속성, 용이성 및 정확성을 확보하는데 도움이 될 것이다.
반면, 소핵시험은 단순 원형의 소핵을 평가하고 이론적으로 평가에 사용하는 세포의 수에 제한이 없으므로, 평가에 사용한 표본 수를 크게 하여 판독 시 분별력을 높이면 시험의 민감도(sensitivity)를 향상시키고 평가자의 주관이 배제되어 더욱 객관성 있는 결과를 얻을 수 있는 장점을 가지고 있어(Lee et al., 2011), 본 연구와 같이 판독 시 분별력을 높일 수 있는 최적화 연구가 vitMNT를 통해 얻은 시험결과의 정확도 향상에 도움이 될 것으로 생각된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
유전독성과 밀접한 연관을 갖는 염색체의 결함은 무엇인가?
이에 따라, 소핵시험도 포유류 배양세포를 이용한 in vitro 소핵시험법(in vitro micronucleus test, vitMNT)이 개발되어, 염색체이상으로 생겨난 염색체의 파편 혹은 딸세포로의 분리에 실패한 온전한 염색체가 다시 핵막으로 싸여 이루어진 소핵(micronucleus, MN)을 관찰하고 그 출현집도를 산출하여 유전독성을 평가하고 있다(OCED, 2017). 유전독성은 염색체의 수적 이상(numerical aberration)과 밀접하게 관련되어 있는데, 다른 유전독성 시험법 중 하나인 염색체이상시험은 염색체의 수적 이상을 유발하는 물질들 중 DNA와 직접 반응을 하지 않는 물질들을 검출하기가 통상적으로 어려운 반면, vitMN 시험은 구조적 이상에 의한 염색체의 파편으로부터 생성된 MN 뿐 아니라 염색체의 수적 이상으로 생성된 소핵 역시 계수가 가능하여 상대적으로 더 넓은 범위의 유전독성을 검색할 수 있다(Lee et al., 2011).
유전독성은 무엇인가?
유전독성은 시험물질이 유전자 또는 염색체에 미치는 상해작용을 평가하는 시험법이며, 농약의 등록과정에서 필수적으로 수행하는 시험항목으로 잠재적인 발암성 또는 돌연변이 유발물질을 검출하기 위해 수행하는 시험이다(OCED, 2014; Kirkland et al., 2011).
in vitro 소핵시험법(in vitro micronucleus test, vitMNT)이 개발된 배경은 무엇인가?
독성시험법들은 동물복지 차원에서 전세계적으로 동물을 사용하지 않고 세포나 조직 등을 이용하는 대체시험법의 개발이 매우 활발하게 진행되고 있다(Yamamoto et al., 2005).
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