알코올성 간 손상 조직에서 TGF-β1와 c-Myc, Erb-B2, Thymosin-β4 유전자 발현 융합 연구 A study of Expression of TGF-β1, c-Myc, Erb-B2 and Thymosin-β4 Gene in Alcoholic Liver Damage Tissue.원문보기
본 연구는 25% 에탄올에 손상된 간조직에서 $TGF-{\beta}_1$와 c-Myc, Erb-B2, $Thymosin-{\beta}_4$ 유전자의 발현을 알아 보고자 실시 하였다. 실험군은 2군으로 나누어 25% 에탄올로 간 손상을 유발한 실험군과 정제수를 투여한 대조군으로 나누어 실험하였다. 검사 결과는 25% 에탄올를 투여 했던 실험군은 대조군에 비하여 $TGF-{\beta}_1$, c-Myc 및 $Thymosin-{\beta}_4$ 유전자의 발현 증가를 알 수 있었으며 Erb-B2 유전자는 뚜렷한 발현을 알 수 없었다. 또한 손상된 간 조직에서 헤마톡실린 에오진 염색을 통한 세포 손상을 관찰 할 수 있었다. 결론적으로 기존 임상에서 간 기능 관련 질병 예방과 질환 판정 시 혈청학적, 조직학적 검사 외에 $TGF-{\beta}_1$, c-Myc 및 $Thymosin-{\beta}_4$의 분자 진단 기법에 의한 유전자 발현 상태를 융합 검사함으로써 간 질환 판정의 보조 자료로 활용 될 수 있을 것으로 사료 된다.
본 연구는 25% 에탄올에 손상된 간조직에서 $TGF-{\beta}_1$와 c-Myc, Erb-B2, $Thymosin-{\beta}_4$ 유전자의 발현을 알아 보고자 실시 하였다. 실험군은 2군으로 나누어 25% 에탄올로 간 손상을 유발한 실험군과 정제수를 투여한 대조군으로 나누어 실험하였다. 검사 결과는 25% 에탄올를 투여 했던 실험군은 대조군에 비하여 $TGF-{\beta}_1$, c-Myc 및 $Thymosin-{\beta}_4$ 유전자의 발현 증가를 알 수 있었으며 Erb-B2 유전자는 뚜렷한 발현을 알 수 없었다. 또한 손상된 간 조직에서 헤마톡실린 에오진 염색을 통한 세포 손상을 관찰 할 수 있었다. 결론적으로 기존 임상에서 간 기능 관련 질병 예방과 질환 판정 시 혈청학적, 조직학적 검사 외에 $TGF-{\beta}_1$, c-Myc 및 $Thymosin-{\beta}_4$의 분자 진단 기법에 의한 유전자 발현 상태를 융합 검사함으로써 간 질환 판정의 보조 자료로 활용 될 수 있을 것으로 사료 된다.
This study has been conducted to see the expression of $TGF-{\beta}_1$, c-Myc, Erb-B2 and $Thymosin-{\beta}_4$ genes in ethanol - damaged liver tissues. Experimental groups were divided into 2 groups, one where damaged liver was caused by 25% ethanol and normal group administer...
This study has been conducted to see the expression of $TGF-{\beta}_1$, c-Myc, Erb-B2 and $Thymosin-{\beta}_4$ genes in ethanol - damaged liver tissues. Experimental groups were divided into 2 groups, one where damaged liver was caused by 25% ethanol and normal group administered with purified water. Results of test showed the expression of $TGF-{\beta}_1$, c-Myc, and $Thymosin-{\beta}_4$ genes was higher in the experimental group treated with 25% ethanol than in the normal group. Erb-B2 gene was not expressed clearly. Thus, it is considered that we can expect to utilize $TGF-{\beta}_1$, c-Myc 및 $Thymosin-{\beta}_4$ as auxiliary data and find clinical meanings of diagnosis on hepatic diseases, In addition to serologic and histological examination by convergence examining the gene expression status by molecular diagnostic techniques in liver-related disease prevention and diagnosis through results of this study.
This study has been conducted to see the expression of $TGF-{\beta}_1$, c-Myc, Erb-B2 and $Thymosin-{\beta}_4$ genes in ethanol - damaged liver tissues. Experimental groups were divided into 2 groups, one where damaged liver was caused by 25% ethanol and normal group administered with purified water. Results of test showed the expression of $TGF-{\beta}_1$, c-Myc, and $Thymosin-{\beta}_4$ genes was higher in the experimental group treated with 25% ethanol than in the normal group. Erb-B2 gene was not expressed clearly. Thus, it is considered that we can expect to utilize $TGF-{\beta}_1$, c-Myc 및 $Thymosin-{\beta}_4$ as auxiliary data and find clinical meanings of diagnosis on hepatic diseases, In addition to serologic and histological examination by convergence examining the gene expression status by molecular diagnostic techniques in liver-related disease prevention and diagnosis through results of this study.
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문제 정의
따라서 본 연구는 간 손상 시 조직에서의 혈액학적인 변화와 전자현미경적 구조 및 광학 현미경의 조직학적인 변화를 관찰하고 손상된 간 조직 내의 Thymosin-β4, c-Myc, Erb-B2, TGF-β1의 mRNA 발현의 차이를 관찰함으로써 임상에 진단과 관련한 참고 자료로 활용하고자 하였다.
따라서 본 연구는 손상된 간조직에서 TGF-β1, 및 c-Myc, Erb-B2, Thymosin-β4 발현 정도를 알아보고자 실시하였다.
제안 방법
RNA추출은 Homogenizer를 이용하여 조직을 파쇄한 후 B사 RNA Prep Kit를 이용하였고 역전사과정은 RNA 20 μl을 사용하여 42°C에서 60 분간 반응시켰으며 전환된 cDNA는 Accupower Greenstar qPCR preMix Kit를 이용하여 Real time PCR 장비로 증폭하였다.
실험동물에서 적출한 일부 간 조직을 10% 포르말린에 24시간 고정 하고 탈수 과정, 투명과정, 침투과정, 포매과정을 거친 후, 생성된 블록을 microtome으로 4~6 μm 박절하였다. 박절 시 나온 리본을 탈 파라핀 과정과 함수 처리 및 염색을 실시하였다. 핵 염색은 Harris-Hematoxylin (YD Diagnostics, korea), 세포질은 에오신Y (Showa, Japan)로 염색을 하였다
실험동물에서 적출한 일부 간 조직을 10% 포르말린에 24시간 고정 하고 탈수 과정, 투명과정, 침투과정, 포매과정을 거친 후, 생성된 블록을 microtome으로 4~6 μm 박절하였다.
실험동물은 평균체중 20~25g의 10주령 된 수컷 BALB/c 마우스를 노터스 회사로부터 공급받아 1주일동안 환경에 적응시켰으며, 알코올성 간 손상을 유발시킬 목적으로 25% Ethanol 단독투여군 (n=5)과 대조군(n=5)으로 분리 후 실험모델 이치호 방법 [41]을 채택하여 실험군은 무수 Ethanol (99.9%, 덕산과학)을 희석한25% Ethanol (5ml/kg)를 매일 1회, 8주 동안 구강 위관영양법으로 투여하였으며. 8주 후 Ether로 마취하고 희생시켰다.
실험동물을 Ether로 마취하고 희생시킨 후 간 조직 일부를 세절한 후 Glutaraldehyde에 고정하여 전자현미경용 표본을 제작하였다. 즉 Glutaraldehyde에 하루 정도 고정한 후 사산화 오스뮴에 2차 고정을 2시간 정도 실시하였으며 수세 후 알코올을 이용한 저 농도에서 고 농도(70% ～ 100%)로 탈수를 하였고, 산화프로필렌을 이용한 치환 과정, 에폰812를 이용한 침투과정, 포매 틀을 이용한 블록제작, 그리고 중합과정을 거친 후 Ultramicrotome을 이용하여 박절 하였으며 초산 우라닐로 전자염색을 한 후 투과전자현미경을 이용하여 조직 관찰을 하였다
실험동물을 Ether로 마취하고 희생시킨 후 간 조직 일부를 세절한 후 Glutaraldehyde에 고정하여 전자현미경용 표본을 제작하였다. 즉 Glutaraldehyde에 하루 정도 고정한 후 사산화 오스뮴에 2차 고정을 2시간 정도 실시하였으며 수세 후 알코올을 이용한 저 농도에서 고 농도(70% ～ 100%)로 탈수를 하였고, 산화프로필렌을 이용한 치환 과정, 에폰812를 이용한 침투과정, 포매 틀을 이용한 블록제작, 그리고 중합과정을 거친 후 Ultramicrotome을 이용하여 박절 하였으며 초산 우라닐로 전자염색을 한 후 투과전자현미경을 이용하여 조직 관찰을 하였다
박절 시 나온 리본을 탈 파라핀 과정과 함수 처리 및 염색을 실시하였다. 핵 염색은 Harris-Hematoxylin (YD Diagnostics, korea), 세포질은 에오신Y (Showa, Japan)로 염색을 하였다
혈청학적 검사는 실험동물을 Ether로 마취하고 희생시킨 후 주사기를 이용하여 700㎕ 이상을 심장에서 채취하였으며 10분간 3,000×g, 4℃에서 원심 분리 후 ALP, ALT, AST 분석에 사용하였다.
데이터처리
실험결과는 평균 ± 표준편차를 구하였으며 SPSS/Windows 19.0을 이용하여 통계 처리하였다.
0을 이용하여 통계 처리하였다. 집단 간의 평균값 유의성 차이는 t 검정을 실시 하였으며 통계적인 유의성은 p = 0.05 수준에서 실시하였다.
이론/모형
실험동물에서 적출한 간 조직 일부를 세절한 후 -70℃에서 냉동 보관하였다가 유전자 mRNA 발현 검사를 위한 Real time PCR에 이용하였으며 유전자 결과 분석방법은 케니스 방법 [42]을 적용하였다. RNA추출은 Homogenizer를 이용하여 조직을 파쇄한 후 B사 RNA Prep Kit를 이용하였고 역전사과정은 RNA 20 μl을 사용하여 42°C에서 60 분간 반응시켰으며 전환된 cDNA는 Accupower Greenstar qPCR preMix Kit를 이용하여 Real time PCR 장비로 증폭하였다.
성능/효과
ALT는 대조군에 비해 25% Ethanol 단독 투여 군에서42.0 U/l로 높게 나타났으며 AST는 대조군에 비해 25% Ethanol 단독 투여군에서 177.8 U/l로 높은 값을 보였다. 또한 ALP는 대조군에 비해 25% Ethanol 투여군 값이 97.
H & E염색 결과는 대조군에 비해 25% Ethanol 단독 투여군에서 중심정맥 주위에 조직변성에 의한 핵농축 (↓)과 저 염색성 (→)을 일으켰으며 핵이 전체적으로 커지는 반응세포핵 (←) 등 이상 세포 등을 볼 수 있었다.
H & E염색 결과는 대조군에 비해 25% Ethanol 단독 투여군에서 중심정맥 주위에 조직변성에 의한 핵농축과 저 염색성을 일으켰으며 핵이 전체적으로 커지는 반응세포핵 등 이상 세포 등을 볼 수 있었다.
Table 3 또한 Real time PCR 결과 분석방법인 케니스 방법 [42]을 이용하여 housekeeping gene인 β-actin 유전자 대조군 발현정도를 1 기준으로 하였을때 25% Ethanol 투여군 발현양은 TGF-β1가 2.46, c-Myc 10.17, Thymosin-β4 2.46으로 유전자 발현이 증가 된 것을 알 수 있었다.
결과에 대하여 살펴보면 알코올성 간 손상 조직에서 전자현미경적 조직변화는 정상 간 조직에서 미토콘드리아 등 세포질 내 소기관은 정상적으로 분포하고 있었으며 특이할 만할 소견을 찾아볼 수 없었지만 25% Ethanol을 처리한 조직에서는 중심 정맥 주위에 용해소체들이 분포하고 있었다.
동시에 미토콘드리아 상태는 속 사립체막(→)의 내부로 돌출된 능선이 뚜렷하지 못하는 등 전체적으로 많은 손상이 있었다.
정상 간 조직에서 미토콘드리아 등 세포질 내 소기관은 정상적으로 분포하고 있었으며 특이할 만할 소견을 찾아볼 수 없었지만 25% Ethanol을 처리한 조직에서는 중심 정맥 주위에 용해소체들이 분포하고 있었다. 동시에 미토콘드리아 상태는 속 사립체막(→)의 내부로 돌출된 능선이 뚜렷하지 못하는 등 전체적으로 많은 손상이 있었다. Fig.
따라서 간 손상 영향 정도를 보여주는 각종 혈청학적, 조직학적 결과와 간 조직 손상에 따른 유전자 발현 정도를 분석하여 본 바 손상 받은 간 조직에서는 TGF-β1, c-Myc 및 Thymosin-β4 유전자의 발현 증가를 알 수 있었으며 Erb-B2 유전자는 뚜렷한 발현을 알 수 없었다.
8 U/l로 높은 값을 보였다. 또한 ALP는 대조군에 비해 25% Ethanol 단독 투여군 값이 97.4 U/l로 높다는 것을 알 수 있었다. 각 평균값에 대한 t 검정은 P < 0.
8 U/l로 높은 값을 보였다. 또한 ALP는 대조군에 비해 25% Ethanol 투여군 값이 97.4 U/l로 높다는 것을 알 수 있었다. 각 평균값에 대한 t 검정은 P < 0.
또한 Real time PCR 결과 분석방법인 케니스 방법 [42]을 이용하여 housekeeping gene인 β-actin 유전자 대조군 발현정도를 1 기준으로 하였을때 25% Ethanol 투여군 발현양은 TGF-β1가 2.46, c-Myc 10.17, Thymosin-β4 2.46으로 유전자 발현이 증가 된 것을 알수 있었다.
46으로 유전자 발현이 증가 된 것을 알수 있었다. 위 결과를 보면 ALT, AST, ALP의 혈청학적 관련 효소의 증가를 알 수 있었는데 이는 알코올에 의한 간조직 손상을 의미하는 것으로 알코올에 의한 간의 독성효과를 의미 한다 [43]는 논문과 알코올 투여시 혈청관련 효소 증가를 보고한 [44]연구 결과와 일치함을 알 수 있었다. 즉 세포막에서 불포화지방산의 과산화반응으로 인하여 막 구조나 기능을 파괴함으로써 간의 단백질 합성을 저해하며 간의 글리코겐(glycogen)양을 감소시키고, 혈중으로 ALT 와 AST 등의 혈청 관련효소 유출의 증가를 나타낸 것이다 [45].
동시에 미토콘드리아 상태는 속 사립체막의 내부로 돌출된 능선이 뚜렷하지 못하는 등 전체적으로 많은 손상이 있었다. 혈청학적 검사는 ALT는 대조군에 비해 25% Ethanol 단독 투여 군에서 42.0 U/l로 높게 나타났으며 AST는 대조군에 비해 25% Ethanol 단독 투여군에서 177.8 U/l로 높은 값을 보였다. 또한 ALP는 대조군에 비해 25% Ethanol 단독 투여군 값이 97.
후속연구
결론적으로 기존 임상에서 간 기능 관련 질병 예방과 질환 판정 시 혈청학적, 조직학적 검사 외에 TGF-β1, c-Myc 및 Thymosin-β4의 분자 진단 기법에 의한 유전자 발현 상태를 검사함으로써 간 질환 판정의 보조 자료로 활용될 수 있을 것으로 사료 된다
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
간장은 어떤식으로 진단이 이루어지는가?
최근 의료 기관에서 조직검사 관련 질병 진단 시HER2 (위암, 유방암) 유전자, BRCA (유방암, 난소암), ALK (폐암), BRAF 돌연변이 유전자검사 (갑상선 유두암), 그리고 P53 (암 억제유전자) 검사 등 FISH, SISH 분자 진단 기법을 이용한 유전자 검사를 많이 시행하고 있다. 그러나 간장은 ALT, AST, AFP등 혈액검사와 간 초음파검사, CT검사 등을 통하여 진단이 주로 이루어지고 있다. 간장은 일반적으로 알코올 대사 과정 중 생성된 아세트 알데히드나 반응성 강한 라디칼 등[1] 으로 혈중에 중성지방 상승에 따른 고지혈증, 간 경변 및 지방간 질환을 유발한다[2].
간 조직 손상 모델은 어떤 동물을 사용하여 실험하였는가?
실험동물은 평균체중 20~25g의 10주령 된 수컷BALB/c 마우스를 노터스 회사로 부터 공급받아 1주일동안 환경에 적응시켰으며, 알코올성 간 손상을 유발시킬 목적으로 25% Ethanol 단독투여군 (n=5)과 대조군(n=5)으로 분리 후 실험모델 이치호 방법 [41]을 채택하여 실험군은 무수 Ethanol (99.9%, 덕산과학)을 희석한25% Ethanol (5ml/kg)를 매일 1회, 8주 동안 구강 위관영양법으로 투여하였으며.
간 질환이 일어나는 원인은 무엇인가?
그러나 간장은 ALT, AST, AFP등 혈액검사와 간 초음파검사, CT검사 등을 통하여 진단이 주로 이루어지고 있다. 간장은 일반적으로 알코올 대사 과정 중 생성된 아세트 알데히드나 반응성 강한 라디칼 등[1] 으로 혈중에 중성지방 상승에 따른 고지혈증, 간 경변 및 지방간 질환을 유발한다[2]. 알코올은 보통 섭취 후 30분 안에 위에서25%정도 흡수되며 나머지는 소장에서 흡수되어 간에서 주로 대사된다[3].
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