[논문]수산가공식품 중 알레르겐 고등어 혼입여부 신속 검출을 위한 간접효소면역분석법의 개발

이정은; 김아윤; 김솔아; 김효인; 박지혜; 심원보

doi:10.13103/jfhs.2018.33.3.185

수산가공식품 중 알레르겐 고등어 혼입여부 신속 검출을 위한 간접효소면역분석법의 개발
Development of an Indirect Enzyme-Linked Immunosorbent assay for Rapid Detection of Adulteration of Food Allergen Mackerel in Processed Marine Foods 원문보기

한국식품위생안전성학회지 = Journal of food hygiene and safety, v.33 no.3, 2018년, pp.185 - 192

이정은 (경상대학교 응용생명과학부) , 김아윤 (경상대학교 응용생명과학부) , 김솔아 (경상대학교 응용생명과학부) , 김효인 (경상대학교 응용생명과학부) , 박지혜 (경상대학교 응용생명과학부) , 심원보 (경상대학교 농업생명과학연구원)

초록
AI-Helper

본 연구에서는 수산가공품 중 고등어 어육을 신속하게 검출하기 위하여 고등어 어육 중 열 안정-수용성 단백질에 특이한 단클론성 항체(3A5-2)를 이용하여 indirect ELISA 법을 개발하였다. Indirect ELISA을 개발하기에 앞서 먼저 시료 전처리는 이전 연구의 결과를 바탕으로 진행되었다. 이전 연구에서는 3A5-2 항체가 37 kDa 부근의 열 안정-수용성 단백질과 반응하였고, 0.05 M carbonate buffer로 추출하였을 때 흡광도가 가장 두드러지게 증가한 것을 확인하였다. 따라서 indirect ELISA의 시료 전처리는 0.05 M carbonate buffer를 이용한 열처리 추출법으로 추출한 후 0.05 M PBS로 희석하는 것으로 확립하였고, indirect ELISA 법을 최적화하였다. 개발된 indirect ELISA법에 실험실에서 임의로 열처리한 고등어 샘플을 적용한 결과 indirect ELISA법은 0.001% (0% 흡광도 표준편차 양의 값: $0.0003{\times}3$)의 검출한계를 확인하였으며, 꽁치 중 고등어는 0.002%(0% 흡광도 표준편차 양의 값: $0.0006{\times}3$)까지 검출이 가능하였다. 또한 조리($100^{\circ}C$, 30분)와 멸균($121^{\circ}C$, 30분) 처리된 고등어의 검출이 가능한 것으로 확인되었고, 멸균된 제품에서도 고등어에 특이적으로 반응하여 고등어의 혼입여부 판별도 가능한 것으로 판단되었다. 시판되는 고등어 가공품에 대해서는 양성결과를 나타내었고 다른 수산물에서는 음성으로 판단되어 개발된 분석법은 가공품에 혼입될 수 있는 알레르겐인 고등어를 보다 신속하고 민감하게 분석할 수 있고, 점차 가격이 증가하고 있는 고등어의 혼입여부를 확인할 수 있는 분석 도구로서 활용이 가능할 것으로 판단된다.

Abstract ▼ AI-Helper

The purpose of this study was to develop an indirect enzyme-linked immunosorbent assay (indirect ELISA) based on a monoclonal antibody (MAb) that is specific to mackerel thermal stable-soluble protein (TSSP), that can be used for the rapid detection of mackerel in processed marine foods. Among the four MAbs (3A5-1, 2, 9, and 12) developed in previous studies, the 3A5-2 MAb that showed high specificity and sensitivity were selected and used to develop the indirect ELISA method. The detection range of the indirect ELISA was 0.02%-0.001% and the detection limit of 0.001% was shown. No cross-reaction to other marine products and food ingredients was observed by the indirect ELISA. Processed marine foods containing mackerel with ${\geq}0.3$ O.D. value at 405 nm were estimated as positive samples by the indirect ELISA. Therefore, the indirect ELISA can be used as a rapid and sensitive method to identify mackerel authenticity and adulteration in processed marine foods.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

, 이러한 열 안정-수용성 단백질은 가공식품 중 존재하는 식품알레르겐의 존재 여부를 확인할 수 있는 마커로써 이용이 가능하다는 것을 보고하였다. 따라서 본 연구에서는 이전의 연구에서 개발한 고등어 어육 중 열 안정-수용성 단백질에 특이한 단크론성 항체를 이용하여 간접효소면역분석법(indirect ELISA)을 개발하였고, 수산가공식품 중 식품 알레르겐으로서의 고등어 어육 혼입여부를 확인하는데 활용하고자 하였다.

제안 방법

또한 식품의약품안전처에서 발표한 “어린이 기호식품 등의 알레르기 유발 식품 표시기준 및 방법” 고시에도 고등어는 식품 알레르겐으로 표시하도록 관리하고 있다²¹⁾. 따라서 본 연구에서는 앞서 개발한 indirect ELISA를 이용하여 식품 중 혼입된 고등어의 검출 가능 여부를 확인하였다. 우선 0.
정제된 단크론성 항체를 이용하여 수산가공품 중 식품 알레르겐 고등어 혼입여부의 신속검출을 위해 민감도와 특이성이 높은 분석법을 개발하고자 indirect ELISA법의 각 단계인 coating, blocking, 1차 항체, 2차 항체에 대한조건을 최적화 하였다.

대상 데이터

본 실험에는 대형마트에서 판매하고 있는 고등어 및 고등어 가공식품류(통조림, 수산물가공품), 꽁치 및 삼치를 사용하였다. 실험에는 Nunc사(Roskilde, Denmark)의 microplate와 Sigma-Aldrich Co.

이론/모형

05M carbonate buffer를 첨가한 후 vortex를 사용하여 30초 동안 균질화 하였다. 균질화된 시료는 100℃ 끓는 물에서 15분 동안 중탕하여 추출하는 열처리(heating) 추출법을 사용하였으며, 추출물은 50 mL의 conical tube로 옮겨 3,221× g에서 10분 동안 원심분리한 후 상층액을 분리하였고 indirect ELISA 분석법에 사용하였다.

성능/효과

고등어 어육 중 열 안정-수용성 단백질에 특이적인 단크론성 항체 4종을 앞서 설명한 바와 같이 ammonium sulfate 법으로 정제하였고, 정제된 항체 4종 중 가장 역가가 높은 항체 1종을 선택하여 indirect ELISA의 최적화를 진행하고자 하였다. Fig. 1에서 보는 바와 같이 4종의 항체를 이용하여 indirect ELISA를 실시한 결과 3A5-1, 3A5-2, 3A5-9와 3A5-12 항체 모두 민감도가 비슷한 것으로 확인되었지만 3A5-2 항체가 고등어 함유량 0.01%에서도 다른 3종의 항체보다 높은 흡광도인 0.749를 나타내어 민감도 측면에서 우수한 것으로 확인되었다. 그러므로 이후 실험에서는 3A5-2 항체를 이용하여 indirect ELISA법 개발을 최적화하였다.
6에서와 같이 모든 조건에서 고등어는 높은 흡광도를 나타내어 양성으로 확인할 수 있었으나 꽁치와 삼치는 음성으로 확인되었다. 따라서 개발된 indirect ELISA법이 수산가공식품 중 고등어의 혼입여부를 확인하는 도구로써의 활용이 가능하다고 판단되었다. 손과 김의 parvalbumin을 항원으로 이용한 ELISA법은 100℃로 처리한 고등어 시료는 검출이 가능하였으나, 121℃에서 처리한 고등어 시료는 검출이 불가능하다고 보고하고 있다¹³⁾.
앞서 개발된 indirect ELISA법에 대해 민감도와 특이성을 확인하였다. 민감도 측정을 위해 고등어 추출액을 0.05M PBS로 1, 0.2, 0.1, 0.02, 0.01, 0.005, 0.002, 0.001, 0%로 희석한 후 indirect ELISA로 확인한 결과 Fig. 4A에서 보는 바와 같이 0.001% (0% 흡광도 표준편차 양의 값 : 0.0003 ×3) 까지 측정이 가능한 민감도 높은 분석법으로 확인 되었다. 또한, 최적화된 indirect ELISA법의 특이성을 확인하기 위해 식품알레르겐으로 알려진 수산물(꽁치,삼치, 볼락, 새우, 오징어), 너트류 및 콩류(땅콩, 호두, 아몬드, 캐슈넛, 대두) 및 축산물(소고기, 돼지고기, 염소고기, 오리고기, 난백)을 앞서 언급한 바와 같이 0.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	식품 알레르기는 어떤 현상인가?	식품 알레르기의 발병은 인체의 면역체계와 깊은 관련이 있으며 특정 항원이 포함된 식품을 섭취하거나 접촉·호흡했을 때 체내 면역글로불린(IgE)이 과도하게 반응하여 나타나는 현상으로, 대다수 사람에게는 별 영향이 없는 식품이지만 특이 체질을 가진 사람은 식품 알레르겐으로 인해 비정상적인 면역반응을 일으킨다. 증상으로는 두드러기·혈관 부종·아토피 피부염 등과 같은 피부 증상이 흔하게 나타나며 설사·구토·복통 등의 소화기 증상과 심한 경우 기관지가 확장되면서 기도가 좁아져 호흡곤란에 이를 수 있다1-3).
	알레르기를 유발하는 식품 알레르겐의 함유유무를 확인하는 방법은?	알레르기를 유발하는 식품 알레르겐의 함유유무를 확인하는 방법으로는 크게 기기분석법(HPLC와 LC-MS/MS),특이항체를 이용하는 면역분석법(ELISA, immuno-strip),대상 DNA를 검출하는 유전자검사법(PCR)으로 나눌 수 있다15,16). 그러나 HPLC법은 표준품과의 머무름시간(retentiontime)을 비교하고, DAD (diode array detector)에서의 spectra를 확인하는 것이 유일한 화학적 정보이며, 분석물질의 표준품을 반드시 확보하고 있어야 하는 단점이 있다.
	식품 알레르겐의 함유유무를 판별하기 위한 방법으로 ELISA법이 있는데, 현재 개발된 kit들은 실제 산업에서 어떤 난점을 가지고 있는가?	실제로 식품산업현장에서 식품 알레르겐의 혼입유무 및 식품 알레르겐을 사용한 시설 및 설비 공정에서의 세척효과를 확인하기 위해 ELISA법과 immuno-strip 등의 면역분석법 kit들이 주로 사용되고 있다. 그러나 현재 개발되어 판매되고 있는 면역분석법 kit들은 알레르기를 유발하는 특정 단백질을 대상으로 개발하였기 때문에 이들 단백질이 살균 및 조리 공정 등의 열처리 과정 중에 변성되면 실제 가공식품에는 적용하기 어려움이 있다고 보고되고 있다9). 현재까지 보고된 연구문헌 중 가공식품에 알레르기 검출 ELISA kit를 적용하였을 때 시판되고 있는 제품 kit 중 약 0.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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