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문제 정의
- 따라서 본 연구에서는 우리나라 국민들이 가장 일반적으로 소비하는 과일류 중 과피 부분을 쉽게 분리할수 있는 사과 또는 배의 과일류 껍질추출물을 활용하여 학습능력 수행 및 기억력 증진 효과에 대해 알아보고자 하였다.
- 알츠하이머성 치매는 전체 치매의 50% 정도를 차지하는데, 알츠하이머성 치매에 의한 인지기능 장애는 학습과 기억에 있어서 중요한 역할을 수행하는 부교감신경의 심각한 손상과 신경전달물질인 아세틸콜린의 감소에 기인하는 것으로 알려져 있다[3, 4]. 이에, 콜린성 기능저하 유도는 사람의 인지력 저하를 위한 효과적인 실험모델로 제시되었다.Scopolamine은 체내 아세틸콜린 수용체에 대하여 항무스카린성 효과를 내는 약물로, 아세틸콜린에스테라제의 활성을 증가시켜 신경접합부에 있는 아세틸콜린을 분해하여 인지력을 감소시키므로 새로운 항치매 약물의 평가를 위한 실험모델에 많이 사용되고 있다[5, 6, 7, 8].
제안 방법
- 모리스 수미로는 직경이 90㎝이고 높이가 약 30㎝인 수조로 수온이 27℃인 수돗물을 2/3정도 채우고, 그 안에 생쥐가 올라갈 수 있는 직경이 10㎝인원통형 platform을 설치하여 제작하였다. 1일 1회 학습 시 30초 이내에 pool에서 platform으로 올라가는 생쥐를 선별하고, 선별된 생쥐 10마리씩을 한 군으로 하여 대조군과 과일껍질 추출물 투여군(200 mg/kg)으로 분류하였다. 이후, 과일껍질 추출물 투여군에는 경구투여로 1주일간 사과껍질 추출물, 배껍질 추출물 또는 사과 껍질과 배껍질의 혼합추출물을 각 군에 따라 매일 투여하면서, 1주에 3회 platform에 오르는 반복훈련을 실시하였다[15, 16].
- Figure 4.의 실험결과에 의하면 scopolamine (1 mg/kg)으로 학습과 기억력이 감퇴된 건망증 생쥐모델을 이용하여 Morris water maze에서 videotracking으로 과일류 껍질추출물 투여에 대한 효과를 관찰하였다. 실험전 1 주일중 (7일) 동안 5일간 Morris water maze pool에서 platform으로 올라가는 반복학습을 계속 실시하여 30초 이내에 pool에서 platform으로 올라가는 생쥐를 선별한 후, 1주일간 약물 투여 후 Scopolamine 투여 30분 후에 videotracking으로 분석한 결과가 Fig.
- LPS는 Gram negative bacteria의 immunostimulatory factor로써 NO의 유도물질로 잘 알려져 있으며, 염증반응을 유도한다. 과일껍질혼합추출물의 효과에 대해서 측정하기 위해서 BV2 세포에서 LPS로 염증반응을 유도하였다. 실험결과 사과껍질과 배껍질 혼합추출물은 LPS에 유도된 염증반응을 상당히 억제하는 것으로 나타났다.
- 7주령의 C57bl/6계 생쥐를 대한바이오링크로부터 분양받아 사용하였다. 분양 받은 실험동물은 표준식이 (조단백질 22.1%이상, 조지방 8.0%이하, 조섬유 5.0%이하, 조회분 8.0%이하, 칼슘 0.6%이상, 인 0.4%이상, 삼양사 Co. Korea)와 물을 자유롭게 공급하면서 1주일 간 실험실 환경에 순화시킨 후 실험에 사용하였다.
- 선별된 C57b1/6계 생쥐에 1주일간의 순화 후 건강상태가 양호한 생쥐를 선별하여 1주일간 모리스 수미로 (Morris water maze)에서 1일 1회 5일간 반복학습을 실시하였다. 모리스 수미로는 직경이 90㎝이고 높이가 약 30㎝인 수조로 수온이 27℃인 수돗물을 2/3정도 채우고, 그 안에 생쥐가 올라갈 수 있는 직경이 10㎝인원통형 platform을 설치하여 제작하였다.
- 건조된 시료는 10 kg/㎠의 압력에서 견딜 수 있는 열처리장치(JISCO, Korea)의 내부 용기에 5배에서 10배의 물과 함께 넣고 150℃에서 2시간동안 열처리하였다. 열처리장치는 외부 용기에 열매를 넣고 정해진 온도와 시간으로 가열하도록 하여, 직접적인 열전달에 의한 시료의 탄화를 방지하였다. 2시간 후 추출물을 일정 농도로 농축한 후, 동결건조하여 냉장고에 보관하며 사용하였다.
- 1일 1회 학습 시 30초 이내에 pool에서 platform으로 올라가는 생쥐를 선별하고, 선별된 생쥐 10마리씩을 한 군으로 하여 대조군과 과일껍질 추출물 투여군(200 mg/kg)으로 분류하였다. 이후, 과일껍질 추출물 투여군에는 경구투여로 1주일간 사과껍질 추출물, 배껍질 추출물 또는 사과 껍질과 배껍질의 혼합추출물을 각 군에 따라 매일 투여하면서, 1주에 3회 platform에 오르는 반복훈련을 실시하였다[15, 16].
- 제조한 사과껍질 추출물(AB, Apple Bark), 배껍질 추출물(PB, Pear Bark), 사과껍질과 배껍질의 1:1(w/w) 혼합 추출물(BF, Bark Formulation의 뇌조직에 대한 아세틸콜린에스테라제(AchE, Acetyl- cholinerase) 억제활성을 AchE assay kit(abcam, ab138871)를 사용하여 평가하였다. 마우스의 뇌조직을 얻기위하여 assay buffer를 뇌조직이 잠기도록 가하여 분쇄한 후 1500×g 로 5분간 원심분리 하여 상층액을 분리하였다.
- 총 14일의 훈련과 7일의 약물 투여가 종료된 C57b1/6계 생쥐에 최종약물 투여 30분 후 각 실험군에 scopolamine(1㎎/㎏)을 복강 주사하고 30분 후에 모리스 수중미로에 생쥐를 한 마리씩 넣고, VIDEOTRACK 으로 행동을 측정하였고, 이를 videotrack software로 분석하였다[17, 18].
- 추출물의 독성효과 측정하기 위해서 3-(4, 5-dimethyl -thiazol-2-yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide 시약을 이용하여 세포생존율을 측정하였다. 접종한 세포에 0.
대상 데이터
- 7주령의 C57bl/6계 생쥐를 대한바이오링크로부터 분양받아 사용하였다. 분양 받은 실험동물은 표준식이 (조단백질 22.
- American Type culture collection에서 얻은 마우스의 신경세포주(미세아교세포) BV2 cell을 37̊C, 5 %CO2 조건에서 8% FBS, 100IU/ml penicillin, 100μg/ml streptomycin sulfate가 첨가된 DMEM 배지에 배양하였다.
- 선별된 C57b1/6계 생쥐에 1주일간의 순화 후 건강상태가 양호한 생쥐를 선별하여 1주일간 모리스 수미로 (Morris water maze)에서 1일 1회 5일간 반복학습을 실시하였다. 모리스 수미로는 직경이 90㎝이고 높이가 약 30㎝인 수조로 수온이 27℃인 수돗물을 2/3정도 채우고, 그 안에 생쥐가 올라갈 수 있는 직경이 10㎝인원통형 platform을 설치하여 제작하였다. 1일 1회 학습 시 30초 이내에 pool에서 platform으로 올라가는 생쥐를 선별하고, 선별된 생쥐 10마리씩을 한 군으로 하여 대조군과 과일껍질 추출물 투여군(200 mg/kg)으로 분류하였다.
- 본 실험에 사용한 실험 재료는 농수산물 도매시장에서 국내산 사과와 배를 구입하여 세척한 후 껍질만 벗겨 사용하였다.
- 사과와 배는 2017년 2월～6월 사이 농수산물 도매시장에서 구입하였으며, 세척 후 물기를 제거하고 껍질만 벗겨 건조하였다. 건조된 시료는 10 kg/㎠의 압력에서 견딜 수 있는 열처리장치(JISCO, Korea)의 내부 용기에 5배에서 10배의 물과 함께 넣고 150℃에서 2시간동안 열처리하였다.
데이터처리
- 실험에서 얻은 결과는 mean±standard error로 기록하였다.
- 유의성 검증은 Student's t-test 분석 방법을 이용하여 p<0.05 수준에서 검정하였다.
이론/모형
- Nitric oxide는 Griess reaction assay에 의해 측정하였다. 24well plate에 접종한 BV2 cell에 총명탕 가미방 추출물을 전 처리하고/하지 않고, LPS(0.
성능/효과
- 열처리 사과껍질 추출물의 AchE 억제활성은 농도에 따라 큰 차이가 없는 것에 반해 배껍질 추출물의 AchE 억제활성은 농도 의존성을 나타내었다. 5~50 ㎍/㎖의낮은 농도에서는 사과껍질 추출물의 AchE 억제활성이 배껍질 추출물에 비해 우수하였으나, 100 ㎍/㎖ 이상의 농도에서는 배껍질 추출물의 AchE 억제활성이 현저하였다. 특히 배껍질과 사과껍질의 혼합 추출물은 사과껍질 또는 배껍질 단독의 추출물에 비해 AchE 억제활성이 높아 혼합에 의한 성분간의 상호작용에 의한 상승효과가 있음을 시사하였으며, 농도가 높아질수록 상승효과는 더욱 증가함을 확인할 수 있었다(Figure 4).
- 과 14.5 ± 5.7 (sec.)으로 대조군에 비하여 54.4%과 66.6%의 유의성 있는 현저한 기억력 감퇴 억제효과가 있었다 (p<0.05.).
- 그래서 본 실험에서는 BV2세포를 이용하여 proinflammatory cytokines의 발현에서 과일껍질추출물의 효과에 대해서 측정해보았고, 실험결과 과일껍질 추출물이 iNOS, COX-2, IL-1β, IL-6 ,TNF-α의 mRNA 발현이 확연히 억제되는 것을 확인하였다(Figure 3).
- 사과와 배는 질기고 거친 식감과 신맛과 떫은 맛이 많은 관능성의 문제로 껍질의 섭취를 꺼려하여 과육으로부터 껍질을 제거하여 식용하는 것을 선호하기는 하지만, 고대로부터 식용해온 것으로 안전성에 대한 우려 없이 사용할 수 있다. 따라서 우리나라 국민들이 가장 일반적으로 소비하는 과채류 중 과피 부분을 쉽게 분리할 수 있는 사과 또는 배의 과채류 껍질추출물을 활용하여 최근 문제시 되고 있는 알츠하이머성 치매를 예방하고 치료할 수 있는지 효과를 알아본 결과, 사과껍질과 배껍질의 혼합 추출물은 사과껍질과 배껍질의 추출물 각각에 비하여 아세틸콜린에스테라제의 억제활성이나 스코폴라민 유도 동물 모델의 수중미로 실험에서 학습능력 수행 및 기억력 증진 효과가 더욱 현저하였다. 이는 추출물에 함유된 성분들 간의 상호작용에 의한 상승효과에 기인한 것으로 예측된다.
- 과일껍질혼합추출물의 효과에 대해서 측정하기 위해서 BV2 세포에서 LPS로 염증반응을 유도하였다. 실험결과 사과껍질과 배껍질 혼합추출물은 LPS에 유도된 염증반응을 상당히 억제하는 것으로 나타났다. 뿐만 아니라 세포생존율 검사에서 아무런 독성을 띄지않는 것으로 나타났다(Figure 1, 2).
- 열처리 사과껍질 추출물의 AchE 억제활성은 농도에 따라 큰 차이가 없는 것에 반해 배껍질 추출물의 AchE 억제활성은 농도 의존성을 나타내었다. 5~50 ㎍/㎖의낮은 농도에서는 사과껍질 추출물의 AchE 억제활성이 배껍질 추출물에 비해 우수하였으나, 100 ㎍/㎖ 이상의 농도에서는 배껍질 추출물의 AchE 억제활성이 현저하였다.
- Figure 5은 반복 학습된 생쥐가 pool에서 platform으로 올라갈 때까지 pool에서 움직이는 운동량을 threshold로 지정하여 적은 운동량 (small movement;Smldist)과 많은 운동량 (large movement; Lardist)을 분석한 결과이다. 운동량은 대조군에 비하여 현저히 감소되었고, 생쥐가 수조에서 움직인 총 운동량 중에서 적은 운동량 (Smldist)과 많은 운동량 (Lardist)의 비율은 대조군에 비하여 상대적으로 과일껍질추출물 투여군에서 많은 운동량 (Lardist)의 비율이 감소됨을 알 수 있었다 (Figure 4). 이는 scopolamine으로 유도된 기억력 감퇴 생쥐와 운동량과의 상관관계가 있음을 추측할 수 있었다.
- 이는 추출물에 함유된 성분들 간의 상호작용에 의한 상승효과에 기인한 것으로 예측된다. 이를 통하여 볼 때 과채류껍질 혼합 추출물은 단기기억 활성 촉진, 장기기억 활성 촉진, AChE 억제활성, ACh 의 활성을 촉진하므로 기억 및 학습 개선에 영향을 주는 것으로 사료된다.
- 5~50 ㎍/㎖의낮은 농도에서는 사과껍질 추출물의 AchE 억제활성이 배껍질 추출물에 비해 우수하였으나, 100 ㎍/㎖ 이상의 농도에서는 배껍질 추출물의 AchE 억제활성이 현저하였다. 특히 배껍질과 사과껍질의 혼합 추출물은 사과껍질 또는 배껍질 단독의 추출물에 비해 AchE 억제활성이 높아 혼합에 의한 성분간의 상호작용에 의한 상승효과가 있음을 시사하였으며, 농도가 높아질수록 상승효과는 더욱 증가함을 확인할 수 있었다(Figure 4).
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