L-carnitine에 의한 인간대장암세포주 증식억제 및 산화적손상 기전 규명 The Anti-Proliferation and Oxidative Damage-Related Mechanism of L-Carnitine in Human Colorectal Cancer Cells원문보기
L-carnitine은 라이신과 메티오닌으로 생합성되며 골격근과 심근을 포함한 다양한 동물조직에서 발견된다. L-carnitine이 포함된 식품으로는 양고기, 소고기, 돼지고기 등이 있고 근육발달에 도움을 주며 뼈를 강화하거나 대사작용을 도와주는 기능을 하여 영양 보조제로 많이 섭취하는 것으로 알려져 있다. 최근 L-carnitine은 제 2형 당뇨병, 골다공증, 대사성 신경증후군 등의 다양한 질병의 약물로도 연구 되고 있으며 암에서는 치료 보조제로 개발되어있다. 하지만 대장암에서의 L-carnitine에 대한 효과 및 기전에 대해서는 명확하지 않고 연구된 바가 없기 때문에 본 연구에서 저자들은 L-carnitine의 효능을 인간대장암세포주 HCT116에서 규명하고자 하였다. L-carnitine은 세포 내 활성산소종 (ROS)를 높은 수준으로 증가시켜 세포 증식을 억제하였다. 또한, 세포 증식과 죽음에 관련한 단백질 ERK1/2와 p38을 유의적으로 활성화 시킨다는 것을 입증하였다. 이때, ERK1/2억제제(PD98059)를 처치하여 ERK1/2의 활성화가 활성산소종 발생 및 세포사멸에 중요하다는 것을 밝혔다. 따라서, 본 연구 결과는 L-carnitine이 대장암세포주의 증식을 억제 할 수 있고 이는 대장암의 치료에 있어 잠재적인 치료 물질이 될 수 있음을 시사하며 이 과정에 관여하는 신호전달기전을 조사하여 항암의 치료기전에서 활성산소종이나 ERK1/2, p38 단백질의 활성화의 중요성을 제시하였다.
L-carnitine은 라이신과 메티오닌으로 생합성되며 골격근과 심근을 포함한 다양한 동물조직에서 발견된다. L-carnitine이 포함된 식품으로는 양고기, 소고기, 돼지고기 등이 있고 근육발달에 도움을 주며 뼈를 강화하거나 대사작용을 도와주는 기능을 하여 영양 보조제로 많이 섭취하는 것으로 알려져 있다. 최근 L-carnitine은 제 2형 당뇨병, 골다공증, 대사성 신경증후군 등의 다양한 질병의 약물로도 연구 되고 있으며 암에서는 치료 보조제로 개발되어있다. 하지만 대장암에서의 L-carnitine에 대한 효과 및 기전에 대해서는 명확하지 않고 연구된 바가 없기 때문에 본 연구에서 저자들은 L-carnitine의 효능을 인간대장암세포주 HCT116에서 규명하고자 하였다. L-carnitine은 세포 내 활성산소종 (ROS)를 높은 수준으로 증가시켜 세포 증식을 억제하였다. 또한, 세포 증식과 죽음에 관련한 단백질 ERK1/2와 p38을 유의적으로 활성화 시킨다는 것을 입증하였다. 이때, ERK1/2 억제제(PD98059)를 처치하여 ERK1/2의 활성화가 활성산소종 발생 및 세포사멸에 중요하다는 것을 밝혔다. 따라서, 본 연구 결과는 L-carnitine이 대장암세포주의 증식을 억제 할 수 있고 이는 대장암의 치료에 있어 잠재적인 치료 물질이 될 수 있음을 시사하며 이 과정에 관여하는 신호전달기전을 조사하여 항암의 치료기전에서 활성산소종이나 ERK1/2, p38 단백질의 활성화의 중요성을 제시하였다.
L-carnitine is found in high levels in muscle tissues. It has been developed as a nutrient and dietary supplement, and also used as a therapeutic supplement in various diseases including type II diabetes, osteoporosis and metabolic neuropathies. However, it is not fully understood how it affects cel...
L-carnitine is found in high levels in muscle tissues. It has been developed as a nutrient and dietary supplement, and also used as a therapeutic supplement in various diseases including type II diabetes, osteoporosis and metabolic neuropathies. However, it is not fully understood how it affects cellular mechanisms in colorectal cancer. Therefore, we attempted to determine the effect of L-carnitine in HCT116 human colorectal cancer cells. First, the HCT116 cells were exposed to L-carnitine for 24 hours at 0-40 mM, and then analyzed for cellular proliferation, oxidative stress and related mechanisms. In a MTT assay, L-carnitine inhibited cellular proliferation and induced reactive oxygen species (ROS) in HCT116 by DCF-DA analysis. To analyze the mechanism of L-carnitine in colorectal cancer cells, we performed a western blot analysis for pERK1/2 and pp38 MAP kinase. The western blot showed that L-carnitine significantly increased protein levels of pERK1/2 and pp38 compared with control. Taken together, we found that L-carnitine has anti-proliferative function via increased ROS and activation of ERK1/2 and p38 pathway in HCT116. These findings suggest that L-carnitine may have an anti-proliferative role on colorectal cancer.
L-carnitine is found in high levels in muscle tissues. It has been developed as a nutrient and dietary supplement, and also used as a therapeutic supplement in various diseases including type II diabetes, osteoporosis and metabolic neuropathies. However, it is not fully understood how it affects cellular mechanisms in colorectal cancer. Therefore, we attempted to determine the effect of L-carnitine in HCT116 human colorectal cancer cells. First, the HCT116 cells were exposed to L-carnitine for 24 hours at 0-40 mM, and then analyzed for cellular proliferation, oxidative stress and related mechanisms. In a MTT assay, L-carnitine inhibited cellular proliferation and induced reactive oxygen species (ROS) in HCT116 by DCF-DA analysis. To analyze the mechanism of L-carnitine in colorectal cancer cells, we performed a western blot analysis for pERK1/2 and pp38 MAP kinase. The western blot showed that L-carnitine significantly increased protein levels of pERK1/2 and pp38 compared with control. Taken together, we found that L-carnitine has anti-proliferative function via increased ROS and activation of ERK1/2 and p38 pathway in HCT116. These findings suggest that L-carnitine may have an anti-proliferative role on colorectal cancer.
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문제 정의
따라서, 다양한 암 연구에서는 활성산소종의 발생을 비특이적으로 증가시킴으로써 암세포 증식을 억제할 수 있는 기전을 규명하기 위해 노력해왔고, 실제로 많은 항암제는 활성산소종을 증가시켜 암세포를 억제한다는 특징이 있다16,18). 따라서 본 연구에서는, 대장암세포주에서 L-carnitine에 의하여 활성산소종의 발현에 대하여 분석하기 위하여 DCFDA 염색법을 수행하여 발현도를 조사하였다. DCF-DA는 활성산소종을 검출할 수 있는 염색 탐침으로, 활성산소종을 측정 할 수 있는 분석법이다19).
하지만, 위 논문들에 서는 L-carnitine에 의한 세포사멸 과정에 관여하는 생리적 변화 혹은 신호전달기전에 대해서는 규명하지 않았다. 본 연구 논문에서는 L-carnitine이 대장암세포주의 세포 증 식을 효과적으로 억제하는 과정에서 활성산소종의 과도한 생성이 일어나고 이 때 ERK1/2 신호전달기전이 관련한다는 것을 증명함으로써 L-carnitine의 항암 기능에 대한 가능성을 제시하였다
최근 연구보고에 따르면 L-carnitine은 ERK1/2 신호전달기전을 경유해 골 형성 관련 유전자의 발현을 증가시킴으로 인간 골아 유사 세포의 분화를 촉진하고, 추가로 제브라피시 배아에서는 L-carnitine이 케타민에 의해서 낮아진 ERK1/2 단백질의 활성을 증가시키며 이 신호전달기전에 의하여 낮아진 심박수가 정상으로 회복된다는 것을 ERK1/2 억제제를 통하여 규명하였다23). 본 연구에서도 마찬가지로 L-carnitine 에 의해 높아진 ERK1/2 및 p38의 활성이 실제로 인간대 장암세포주의 세포 사멸이나 활성산소종을 유도하는지 알아보기 위하여 ERK1/2 억제제(PD98059), p38 억제제(SB202190)를 사용하여 ERK1/2 및 p38이 억제되었을 때 L-carnitine이 활성산소종을 증가시키지 못하는지 조사하였다(Fig. 3B).
추가로, Bangxing Hong연구팀은 유방암에서 p38이 치료 기전이 될 수 있다는 것을 밝혔고 이 과정에서 활성산소종이 관여한다고 보고했다22). 본 연구팀은 인간대장암세포주에서 L-carnitine이 어떤 신호전달기전을 통하여 세포사멸 및 활성산소종을 발생시키는지 궁금하였기에 L-carnitine 처치에 따른 ERK1/2 및 p38의 단백질 활성에 대하여 조사하였다. L-carnitine 처치에 의하여 인간대장암세포주에서 ERK1/2 와 p38의 인산화가 촉진되는 것을 확인하였다(Fig.
최근 L-carnitine은 제 2형 당뇨병, 골다 공증, 대사성 신경증후군 등의 다양한 질병의 약물로도 연구되고 있으며 암에서는 치료 보조제로 개발되어있다. 하지만 대장암에서의 L-carnitine에 대한 효과 및 기전에 대해서는 명확하지 않고 연구된 바가 없기 때문에 본 연구에서 저자들은 L-carnitine의 효능을 인간대장암세포주 HCT116에서 규명하고자 하였다. L-carnitine은 세포 내 활 성산소종 (ROS)를 높은 수준으로 증가시켜 세포 증식을 억제하였다.
제안 방법
3C), p38 억제제에 의해서는 변화하지 않았다 (결과는 명시하지 않음). 더 나아가, 세포사멸과정에 관여하는지 알아보기 위하여 세포 사멸과 관련한 단백질인 bcl-2, BAX의 발현량을 분석하였다. Bcl-2 단백질은 세포 사멸을 억제하는데 관여하고 BAX 단백질은 세포사멸이 유도될 때 관여하는 단백질이다.
무한 증식하는 암세포의 특성을 감안할 때 암세포의 증식을 억제하는 것은 항암에 있어 중요한 과제라고 할 수 있다. 따라서, 본 연구에서는 L-carnitine에 의해 세포 증식의 변화를 측정하기 위해 MTT assay를 수행하여 생존률을 측정하였다. L-carnitine은 10~40 mM 농도로 각각 처치하였으며, 현미경 상에서 이루어진 세포의 형태학적 분 석에서는 20 mM, 30 mM 그리고 40 mM에서 농도가 높아짐에 따라 세포의 밀도가 감소하는 것으로 관찰되었다 (Fig.
대상 데이터
In vitro 연구에서 사용한 인간대장암세포주 HCT116 (No.10247)은 한국세포주은행(KCLB)에서 구입하였다. 모든 세포주는 세포배양기에서 5% CO2, 그리고 37°C의 온도를 유지하며 배양하였고 배양액은 1% penicillin streptomycin과 10% 우태아혈청(FBS)을 함유한 RPMI-1640 배지를 사용하였다.
실험결과는 평균값과 표준편차를 나타내었다. 모든 실험 결과의 유의성평가는 1-way-ANOVA 검정 Bonferroni’s 다중검정법으로 실시하였으며, 대조군과 비교하여 P<0.05일 때 유의적이라고 판단하였다. 모든 그래프는 GraphPad prism 5 프로그램을 이용하여 나타내었다.
실험결과는 평균값과 표준편차를 나타내었다. 모든 실험 결과의 유의성평가는 1-way-ANOVA 검정 Bonferroni’s 다중검정법으로 실시하였으며, 대조군과 비교하여 P<0.
이론/모형
세포 내 활성산소종을 측정하기 위하여 2, 7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCF-DA) 염색법을 수행하였다. 세포는 6 well plate에 5×105개의 개수로 넣어 부착하였고 이후 부착된 세포의 배양액을 제거한 후 1X PBS로 세척한 뒤 10 μM의 DCF-DA를 30분 동안 처리하였다.
세포의 생존률을 조사하기 위하여 MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5 diphenyl tetrazolium bromide) assay를 수행하였다. HCT116 세포주는 24 well plate에 1×105개의 개수로 넣어 부착하였고 이후 부착된 세포의 배양액을 제거하고 1X PBS로 2번 세척한 뒤 L-carnitine을 각각 다른 농도로 배양액에 희석하였다 (0, 10, 20, 30, 40 mM).
성능/효과
본 연구팀은 인간대장암세포주에서 L-carnitine이 어떤 신호전달기전을 통하여 세포사멸 및 활성산소종을 발생시키는지 궁금하였기에 L-carnitine 처치에 따른 ERK1/2 및 p38의 단백질 활성에 대하여 조사하였다. L-carnitine 처치에 의하여 인간대장암세포주에서 ERK1/2 와 p38의 인산화가 촉진되는 것을 확인하였다(Fig. 3A).
DCF-DA는 활성산소종을 검출할 수 있는 염색 탐침으로, 활성산소종을 측정 할 수 있는 분석법이다19). 결과적으로, 30 mM 농도의 L-carnitine은 높은 수준으로 활성산소종을 증가시켰으며, 24시간뿐만 아니라 48시간 처치 시에도 그러하였다(Fig. 2A, 2B).
종합해보면, 본 연구에서 L-carnitine은 ERK1/2와 p38 신호전달기전을 통하여 대장암세포주의 활성산소종을 높은 수준으로 증가시키고 세포사멸을 유도한다는 것을 말해준다. 따라서, Lcarnitine의 대장암세포주의 세포사멸을 유도시키는 능력은 암세포의 특징인 무한 증식을 억제하는 데 기여하며 이는 항암 연구에 있어 중요한 치료적 물질이 될 수 있음을 시사한다.
이때, ERK1/2 억제제(PD98059)를 처치하여 ERK1/ 2의 활성화가 활성산소종 발생 및 세포사멸에 중요하다는 것을 밝혔다. 따라서, 본 연구 결과는 L-carnitine이 대장 암세포주의 증식을 억제할 수 있고 이는 대장암의 치료에 있어 잠재적인 치료 물질이 될 수 있음을 시사하며 이 과정에 관여하는 신호전달기전을 조사하여 항암의 치료기전에서 활성산소종이나 ERK1/2, p38 단백질의 활성화의 중요성을 제시하였다.
2A, 2B). 따라서, 본 연구결과는 L-carnitine은 높은 수준의 활성산소종을 발생시켜 세포의 증식을 억제할 수 있음을 시사한다.
1B). 본 연구결과는 L-carnitine이 대장암세포주의 증식을 억제할 수 있다는 것을 제시하였다.
Bcl-2 단백질은 세포 사멸을 억제하는데 관여하고 BAX 단백질은 세포사멸이 유도될 때 관여하는 단백질이다. 본 연구에서, L-carnitine에 의하여 증가된 BAX 단백질과 감소된 Bcl-2 단백질은 ERK1/2 억제제에 의하여 무력화 됨을 확인하였다(Fig. 3D).
3D). 종합해보면, 본 연구에서 L-carnitine은 ERK1/2와 p38 신호전달기전을 통하여 대장암세포주의 활성산소종을 높은 수준으로 증가시키고 세포사멸을 유도한다는 것을 말해준다. 따라서, Lcarnitine의 대장암세포주의 세포사멸을 유도시키는 능력은 암세포의 특징인 무한 증식을 억제하는 데 기여하며 이는 항암 연구에 있어 중요한 치료적 물질이 될 수 있음을 시사한다.
후속연구
추후 연구에서 L-carnitine의 장기적인 노출에 대한 검증이 필요할 것으로 판단되고 암세포와 정상세포에서의 기전 및 역할 규명이 필요하고 더 나아가, p38 및 ERK1/2 활성화의 항암 기전에 대한 추가 연구가 필요하다고 판단된다. 더불어, L-carnitine이 가진 항암보조제의 효과를 규명할 때, 이전에 보고된 L-carnitine을 과 복용한 뒤 느끼 는 메스꺼움 혹은 어지러움과 같은 부작용26에 대하여 충분히 고려되어야 할 것이고, 실험적으로 안정성이나 효율성에 대한 효능 검증을 생체 외 실험뿐만 아니라 생체 내 실험으로 명확히 규명해야 될 것으로 사료된다.
추후 연구에서 L-carnitine의 장기적인 노출에 대한 검증이 필요할 것으로 판단되고 암세포와 정상세포에서의 기전 및 역할 규명이 필요하고 더 나아가, p38 및 ERK1/2 활성화의 항암 기전에 대한 추가 연구가 필요하다고 판단된다. 더불어, L-carnitine이 가진 항암보조제의 효과를 규명할 때, 이전에 보고된 L-carnitine을 과 복용한 뒤 느끼 는 메스꺼움 혹은 어지러움과 같은 부작용26에 대하여 충분히 고려되어야 할 것이고, 실험적으로 안정성이나 효율성에 대한 효능 검증을 생체 외 실험뿐만 아니라 생체 내 실험으로 명확히 규명해야 될 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
암세포의 특징은?
현대 의학에서 특정 지표를 표적 할지라도 다른 조직에서 내성을 획득하게 됨으 로써 여전히 대장암에 의한 사망률은 높아지고 있기 때문에 이를 억제할 수 있는 효과적인 치료법의 개발이 요구 되고 있다. 암세포의 특징 중 하나는 무한 증식할 수 있다는 것인데, 제한적이지 않은 세포 증식은 일반적인 조직 세포 들의 순수한 기능을 방해할 뿐만 아니라 다른 조직에 전이 되어 증식할 수 있다3). 암 환자에서, 특정 암세포의 전이는 치료가 어려울 뿐 아니라 예후가 좋지 못하기 때문에 암세포의 증식 억제가 항암 기전 연구에 있어서 가장 중요한 과제가 될 수 있다.
지방 분해에 있어 L-carnitine의 기능은?
L-carnitine은 라이신과 메티오닌에 의하여 생성되는 효소로 동물의 골격근 또는 심근을 포함하는 다양한 조직에 존재한다5 . 이는 지방 분해 과정에 있어 지방산을 미토콘드리 아로 옮기고 지방산을 분해함으로써 에너지를 생성해내는 물질로 근육 조직을 강화하는데 효과적이다6). L-carnitine이 가장 많이 들어있는 식품은 양고기로 100 g 당 209 mg 이상 함유되어 있다고 알려져 있으며 소고기가 대략 60g/100 g정도로 그 뒤를 잇는다7).
L-carnitine이란 무엇인가?
L-carnitine은 라이신과 메티오닌에 의하여 생성되는 효소로 동물의 골격근 또는 심근을 포함하는 다양한 조직에 존재한다5 . 이는 지방 분해 과정에 있어 지방산을 미토콘드리 아로 옮기고 지방산을 분해함으로써 에너지를 생성해내는 물질로 근육 조직을 강화하는데 효과적이다6).
참고문헌 (26)
Jung, K.W., Won, Y.J., Kong, H.J., Oh, C.M., Cho, H., Lee, D.H., Lee, K.H.: Cancer statistics in Korea : incidence, mortality, survival, and prevalence in 2012. Cancer Res Treat, 47, 127-141 (2015).
Oh, C.M., Won, Y.J., Jung, K.W., Kong, H.J., Cho, H., Lee, J.K., Lee, D.H., Lee, K.H.: Cancer Statistics in Korea : Incidence, Mortality, Survival, and Prevalence in 2013. Cancer Res Treat, 48, 436-450 (2016).
Lee, J., Park, J.R., Lee, H., Jang, S., Ryu, S.M., Kim, H., Kim, D., Jang, A., Yang, S.R.: L-carnosine induces apoptosis/cell cycle arrest via suppression of NF-kappaB/STAT1 pathway in HCT116 colorectal cancer cells. In Vitro Cell Dev Biol Anim, 54, 505-512 (2018).
Jang, S., Lee, J., Ryu, S.M., Lee, H., Park, J.R., Kim, H.J., Kim, D.W., Jang, A, Yang, S.R.: Effect of coenzyme Q10 via nitric oxide production and growth arrest of human colon cancer HCT116 cells. J. Prev. Vet. Med., 41, 59-65 (2017).
Shimada, K., Sakuma, Y., Wakamatsu, J., Fukushima, M., Sckikawa, M., Kuchida, K., Mikami, M.: Species and muscle differences in L-carnitine levels in skeletal muscles based on a new simple assay. Meat Sci, 68, 357-362 (2004).
Murad, H.A.: L-Carnitine, but not coenzyme Q10, enhances the anti-osteoporotic effect of atorvastatin in ovariectomized rats. J. Zhejiang Univ. Sci. B. B, 17, 43-53 (2016).
Mingrone, G., Greco, A.V., Capristo, E., Benedetti, G., Giancaterini, A., De Gaetano, A., Gasbarrini, G.: L-carnitine improves glucose disposal in type 2 diabetic patients. J Am Coll Nutr, 18, 77-82 (1999).
de Sa Junior, P.L., Camara, D.A.D., Porcacchia, A.S., Fonseca, P.M.M., Jorge, S.D., Araldi, R.P., Ferreira, A.K.: The Roles of ROS in Cancer Heterogeneity and Therapy. Oxid Med Cell Longev, 2017, 2467940 (2017).
Galadari, S., Rahman, A., Pallichankandy, S., Thayyullathil, F.: Reactive oxygen species and cancer paradox : To promote or to suppress? Free Radic Biol Med, 104, 144-164 (2017).
Yang, J., Zhao, X., Tang, M., Li, L., Lei, Y., Cheng, P., Guo, W., Zheng, Y., Wang, W., Luo, N., Peng, Y., Tong, A., Wei, Y., Nie, C., Yuan, Z.: The role of ROS and subsequent DNA-damage response in PUMA-induced apoptosis of ovarian cancer cells. Oncotarget, 8, 23492-23506 (2017).
Wang, P., Zeng, Y., Liu, T., Zhang, C., Yu, P.W., Hao, Y.X., Luo, H.X., Liu, G.: Chloride intracellular channel 1 regulates colon cancer cell migration and invasion through ROS/ERK pathway. World J. Gastroenterol., 20, 2071-2078 (2014).
Roscilli, G., Marra, E., Mori, F., Di Napoli, A., Mancini, R., Serlupi-Crescenzi, O., Virmani, A., Aurisicchio, L., Ciliberto, G.: Carnitines slow down tumor development of colon cancer in the DMH-chemical carcinogenesis mouse model. J Cell Biochem, 114, 1665-1673 (2013).
Park, S.J., Park, S.H., Kim, J.O., Kim, J.H., Park, S.J., Hwang, J. J., Jin, D.H., Jeong, S.Y., Lee, S.J., Kim, J.C., Kim, I., Cho, D.H.: Carnitine sensitizes TRAIL-resistant cancer cells to TRAIL-induced apoptotic cell death through the up-regulation of Bax. Biochem Biophys Res Commun, 428, 185-190 (2012).
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