[국내논문]인디언구스베리와 님잎 추출물을 함유한 복합 처방의 항산화 및 숙취해소 효과 Antioxidant and Hangover Cure Effects of Compound Prescription Containing Phyllanthus emblica and Azadirachta Indica Leaf Extract원문보기
The purpose of this study was to investigate the antioxidant and hangover cure effects of compound prescription containing Phyllanthus emblica and Azadirachta Indica leaf extract (CP). In vitro experiments, HepG2 cells were induced oxidative stress by hydrogen peroxide (H2O2) and treated with CP at ...
The purpose of this study was to investigate the antioxidant and hangover cure effects of compound prescription containing Phyllanthus emblica and Azadirachta Indica leaf extract (CP). In vitro experiments, HepG2 cells were induced oxidative stress by hydrogen peroxide (H2O2) and treated with CP at 50, 100, 200 ㎍/㎖ concentration. Antioxidant enzyme (superoxide dismutase (SOD), catalse (CAT), glutathione peroxidase (GPx), glutathione reductase (GR) activity and glutathione (GSH) content were decreased by hydrogen peroxide-induced oxidative stress, but CP was increased that. In vivo experiments, experiment rats were orally administered alcohol 3 g/kg and, after 30 min administered CP 200 mg/kg. After 1 and 3 h of alcohol administration, blood was collected from the tail vein, while after 5 h, blood was collected from the heart. CP modulates alcohol dehydrogenase (ADH) and acetaldehyde level, thereby decreased alcohol level in serum. Also, CP decreased the levels of aspartate aminotransferase (AST) and alkaline phosphatase (ALP). These results suggest that CP has antioxidant effects and alleviates alcohol hangover symptoms.
The purpose of this study was to investigate the antioxidant and hangover cure effects of compound prescription containing Phyllanthus emblica and Azadirachta Indica leaf extract (CP). In vitro experiments, HepG2 cells were induced oxidative stress by hydrogen peroxide (H2O2) and treated with CP at 50, 100, 200 ㎍/㎖ concentration. Antioxidant enzyme (superoxide dismutase (SOD), catalse (CAT), glutathione peroxidase (GPx), glutathione reductase (GR) activity and glutathione (GSH) content were decreased by hydrogen peroxide-induced oxidative stress, but CP was increased that. In vivo experiments, experiment rats were orally administered alcohol 3 g/kg and, after 30 min administered CP 200 mg/kg. After 1 and 3 h of alcohol administration, blood was collected from the tail vein, while after 5 h, blood was collected from the heart. CP modulates alcohol dehydrogenase (ADH) and acetaldehyde level, thereby decreased alcohol level in serum. Also, CP decreased the levels of aspartate aminotransferase (AST) and alkaline phosphatase (ALP). These results suggest that CP has antioxidant effects and alleviates alcohol hangover symptoms.
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문제 정의
효과를 확인하고자 한다. Nelson NG등의 연구방법25)에 따라 알코올을 투여한 실험동물에서의 혈중 알코올과 알코올 대사 관련 효소 수준 변화 및 간 기능에 미치는 영향을 객관적으로 검증하여 항산화 및 숙취해소 효과가 있는 복합 처방으로써 사용가능성을 제고하고자 한다.
이에 본 연구에서는 인디언구스베리와 님잎 추출물을 함유한 복합 처방의 항산화 효능을 확인하기 위해 인간 유래 간세포인 HepG2 세포 내 항산화 효소의 활성을 확인하고 숙취해소에 미치는 효과를 확인하고자 한다. Nelson NG등의 연구방법25)에 따라 알코올을 투여한 실험동물에서의 혈중 알코올과 알코올 대사 관련 효소 수준 변화 및 간 기능에 미치는 영향을 객관적으로 검증하여 항산화 및 숙취해소 효과가 있는 복합 처방으로써 사용가능성을 제고하고자 한다.
제안 방법
96 well plate에 HepG2 세포를 2×104 cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양 하였다 실험을 하기 전에 새로운 배양액으로 교체하였고, CP를 각각 50, 100, 200, 400 ㎍/㎖의 농도로 처리하여 다시 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 10 ㎕의 EZ-Cytox 용액을 첨가하여 세포 배양기에서 30분간 반응시켰다.
Cumene hydroperoxide solution을 10 ㎕씩 넣은 후 실온에서 5분 동안 반응 시킨 뒤 340 ㎚ 파장에서 흡광도를 2차 측정한다. GPx의 활성은 ΔOD 값(2차 측정-1차 측정)으로 kit 상의 NADPH standard 검량선에 따라 계산되었다.
16 ㎎/㎖)를 50 ㎕씩 넣어준 뒤 412 ㎚ 파장에서 5분 동안 1분 간격으로 흡광도를 측정하였다. GSH 농도를 표준용액의 정량곡선을 기준으로 계산하였다.
및 함량에 미치는 영향을 확인하였다. 다음으로 알코올성 간 손상 동물 모델에 투여하여 시간 경과에 따른 혈중 알코올, 알코올 탈수소 함량, 아세트알데히드 함량을 분석하였다.
동안 배양하였다. 배양 후 새로운 배양액으로 교체하였고 CP를 각각 50, 100, 200 ㎍/㎖의 농도로 1 mM H2O2와 함께 처리하여 다시 24시간 동안 배양하였다. 시료가 처리된 HepG2 세포를 PBS로 1회 세척한 뒤 차가운 HEPES buffer (pH 7.
본 연구에서는 in vitro에서 인디언구스베리와 님잎 추출물을 포함하는 복합 처방을 인간의 간세포인 HepG2 세포에 처리한 후 H2O2를 처리하여 유발된 산화적 스트레스에 대하여 항산화 효소 활성 및 함량에 미치는 영향을 확인하였다. 다음으로 알코올성 간 손상 동물 모델에 투여하여 시간 경과에 따른 혈중 알코올, 알코올 탈수소 함량, 아세트알데히드 함량을 분석하였다.
분리한 혈청 300 ㎕를 biochemistry auto analyser에 주입하고 진단검사 의학적 가이드라인 (clinical and laboratory standards institute, CLSI)를 기준으로 간 기능 지표인자인 AST (aspartate aminotransferase), ALT (alanine aminotransferase), ALP (alkaline phosphatase) 함량을 분석하였다.
실험군에는 200 ㎎/㎏ 농도의 CP를 투여하였다. 시간에 따른 효능을 확인하기 위해 알코올 투여 후 1, 3 시간 후에 실험동물의 꼬리 정맥에서 혈액을 채취하였고 5시간 후에는 심장에서 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액은 상온에서 30분간 굳히고 4℃, 3000 g 에서 15분간 원심분리를 통해 혈청으로 분리하였고 초저온 냉동 (-80℃) 보관하면서 실험에 사용하였다.
96 well plate에 상등액 10 ㎕와 working mix solution 150 ㎕를 넣어주었다. 실온에서 5분 동안 반응시킨 후 NADPH (0.16 ㎎/㎖)를 50 ㎕씩 넣어준 뒤 412 ㎚ 파장에서 5분 동안 1분 간격으로 흡광도를 측정하였다. GSH 농도를 표준용액의 정량곡선을 기준으로 계산하였다.
실험동물은 18시간 절식시킨 뒤 대조군과 실험군에 3 g/㎏의 알코올을 투여하였으며, 알코올 투여 30분 후에 대조군에는 증류수, 실험군에는 200 ㎎/㎏ 농도의 CP를 투여하였다. 시간에 따른 효능을 확인하기 위해 알코올 투여 후 1, 3 시간 후에 실험동물의 꼬리 정맥에서 혈액을 채취하였고 5시간 후에는 심장에서 혈액을 채취하였다.
rate ㈜라 온 바이오 (Korea)에서 분양받아 사용하였다. 실험동물은 2주간의 안정기를 가지면서 순화를 시켰으며, 안정기 및 실험기간에 모든 실험군에는 일반 사료 (Altromin, Germany)와 물을 충분히 공급하였다. 동물 사육실의 조건은 conventional system으로 22±2℃, 1 일 중 12시간은 200-300 Lux로 조명하고, 12시간은 모든 빛을 차단하였다.
측정하였다. 이후, 상온에서 30분간 반응시킨 후, 다시 한 번 micro plate reader를 통해 565 ㎚ 파장에서 측정하여 함량을 계산하였다.
대상 데이터
HepG2 세포는 10% FBS와 1% penicillin-streptomycin으로 구성된 DMEM 배지를 사용하였으며 37℃, 5% CO2 조건이 유지되는 세포 배양기에서 배양하였고 2-3일 주기로 계대 배양하여 실험을 진행하였다.
본 실험을 위하여 사용된 5주령의 수컷 SD. rate ㈜라 온 바이오 (Korea)에서 분양받아 사용하였다. 실험동물은 2주간의 안정기를 가지면서 순화를 시켰으며, 안정기 및 실험기간에 모든 실험군에는 일반 사료 (Altromin, Germany)와 물을 충분히 공급하였다.
본 실험을 위하여 사용된 5주령의 수컷 SD. rate ㈜라 온 바이오 (Korea)에서 분양받아 사용하였다.
실험에 사용된 인디언구스베리, 님잎, 오크라, 히비스커스는 인도에서 공급받았으며, 나머지 약재는 ㈜옴니허브에서 구입하여 난치성 면역질환 동서생명연구센터 (RIC-TBRC)에서 확인 후 사용하였습니다. 이후 Table 1과 같이 구성된 약재들 (이하, CP로 표기) 에증류수 1ℓ를 넣어 3시간동안 환류추출 하였으며, paper filter로 여과하고 rotary vacuum evaporator를 사용하여 감압 농축하였다.
데이터처리
실험 결과는 SPSS 21.0를 이용하여 mean±standard error of mean으로 나타내었으며, ANOVA를 사용하여 다중 비교하였고 Tukey’s HSD test를 통해 p<0.05, p<0.01 및 p<0.001 수준에서 유의성을 검정하였다.
성능/효과
HepG2 세포에서 세포생존율을 측정한 결과, 대조군을 100.00±0.32%로 나타냈을 때, 50, 100, 200, 400 ㎍/㎖ 농도에서 각각 100.22±0.41%, 100.31±0.86%, 100.92±1.31%, 79.53±0.92%로 나타났다(Fig. 1).
SD. Rat을 이용한 동물 병태 모델에서는 시간(1, 3 및 5시간) 에 따라 채취한 혈중 에탄올, alcohol dehydrogenase(ADH) 및아세트알데히드 농도의 변화를 관찰한 결과 시간 경과에 따라 대조군에 비해 혈중 에탄올과 아세트알데히드 함량은 유의적으로 감소하였고, ADH는 유의적으로 증가한 결과를 통해 본 연구에 사용한 복합 처방의 숙취제거 효능이 인정되었다. 제품의 안정성을 확인하기 위하여 AST, ALT 및 ALP 활성을 측정한 결과, ALT는 정상군, 대조군, 실험군 사이에서 차이가 나타나지 않았고 AST와 ALP 는 대조군에 비해 유의성 있는 감소가 나타난 결과로 안정성과 간 손상 억제 효과가 검증되었다.
간세포를 비롯하여 생체 내 세포는 지질과산화물의 체내 축적을 억제시키기 위해 1차 방어기전으로 효소계 산화방어 기전을 보유하고 있는데 superoxide dismutase (SOD), catalase 및 glutathione peroxidase (GPx) 등을 말하며31-33) SOD는 생체 내 유해한 활성산소를 과산화수소 분자와 산소분자로 전환(2O2-+2H+⟶ H2O2+O2) 시키고, 생성된 H2O2는 GPx나 catalase에 의하여 물 분자와 산소분자로 전환시키며 세포막과 세포 내 여러 부분에서 특이적으로 작용하여 조직의 과산화를 억제하여 생체를 보호하는 것으로 알려져 있다34, 35). 따라서 본 연구에서 CP를 산화스트레스 상황에 처리하여간 세포의 항산화 효소 활성도를 측정한 결과, Fig. 2에서 보여주듯이 CP를 처리한 군은 H2O2에 의해 감소된 항산화 효소 활성을 유의하게 증가시킴으로써 산화스트레스에 대한 항산화 효과를 객관적으로 확인할 수 있었다.
확인하였다. 따라서 인디언구스베리와 님잎 추출물을 포함하는 복합 처방이 숙취 해소 기능성 식품 소재로서 활용 가능성이 충분할 것이라 사료되며, 아울러 처방 구성 약물 모두 이미 식품으로 등재되어 있어 산업화 가능성이 높을 것으로 보인다.
알코올의 최소 대사산물인 아세트알데히드는 강력한 독성물질로서 알코올에 비해 반응성이 매우 높고 독성이 강한 알코올성 간장해의 주원인 물질이며38), 숙취를 유발하는 원인 물질로 혈액 중에 축적될 경우 더 심한 숙취 증상을 유발할 수 있다39). 본 연구 결과 혈액 내 알코올, 아세트알데히드 농도는 대조군에 비하여 실험군에서 보다 낮게 나타났고, ADH 농도는 대조군에 비하여 실험군에서 보다 높게 나타났다. 아세트알데히드 함량을 분석한 결과, 실험군은 1시간 후에서 대조군에 비해 높게 나타났는데, 이는 CP 투여시 알코올 투여 후 초기에 알코올 분해가 촉진되면서 대조군에 비해 알코올 대사의 중간 산물인 아세트알데히드 함량이 높게 나타난 것으로 보여진다.
본 연구는 HepG2 세포에 H2O2를 처리하여 산화적스트레스를유도하고 인디언구스베리와 님잎 추출물을 포함하는 복합 처방을 처리했을 때, 감소된 항산화 효소 SOD, catalase, GPx, GR의 활성을 증가시켰고 GSH의 힘량을 유의적으로 증가시켰다.
따라서 AST, ALT 및 ALP의 순환계로의 방출은 알코올에 의한 독성화 과정 동안에 간 조직 막에 심각한 손상이 있었음을 의미한다40). 본 연구에서는 알코올 투여 후 손상된 간에 대한 인디언구스베리와 님잎 추출물을 함유하는 복합 처방의 영향을 검토하고자 혈액 내 AST, ALT, ALP 활성을 측정한 결과 ALT는 정상군, 대조군, 실험군에서 차이가 나타나지 않았고 AST와 ALP가 대조군에 비해 CP 투여군이 유의성 있는 감소를 나타낸 결과를 통해 간 손상을 억제하는 효과가 있을 것으로 사료된다.
세포 내 항산화 효과를 측정한 결과, CP 처리군은 SOD, Catalase, GR과 GSH에서 대조군에 비해 200 ㎍/㎖ 농도에서 유의성 있는 (* : p<0.05) 증가를 나타내었으나, GPx에서는 모든 농도에서 유의성이 나타나지 않았다(Table 2)(Fig. 2).
본 연구 결과 혈액 내 알코올, 아세트알데히드 농도는 대조군에 비하여 실험군에서 보다 낮게 나타났고, ADH 농도는 대조군에 비하여 실험군에서 보다 높게 나타났다. 아세트알데히드 함량을 분석한 결과, 실험군은 1시간 후에서 대조군에 비해 높게 나타났는데, 이는 CP 투여시 알코올 투여 후 초기에 알코올 분해가 촉진되면서 대조군에 비해 알코올 대사의 중간 산물인 아세트알데히드 함량이 높게 나타난 것으로 보여진다. 이후 3, 5시간 후에서는 아세트알데히드가 감소되었다.
알코올과 CP를 병행하여 섭취 시 나타날 수 있는 간 기능에 미치는 영향을 평가하기 위하여 간 손상의 평가 지표로 이용되고 있는 AST, ALT 및 ALP 수준의 변화를 측정하고자 혈액을 통한 생화학 분석한 결과, CP 투여군은 AST와 ALP에서 대조군에 비해 유의성 있는 (** : p<0.01, *** : p<0.001) 감소가 나타났으나, ALT에서는 차이가 나타나지 않았다(Table 6)(Fig. 6).
이상의 결과들을 종합해보면 인디언구스베리와 님잎 추출물을 포함하는 복합 처방은 간 세포에서의 항산화 효소의 활성이 확인되었으며, 식품의약품안전평가원에서 발간한 건강기능식품 기능성 평가 가이드-‘간 건강에 도움을 줄 수 있음’편25)에 준하여 숙취 해소 및 알코올 간 보호에 대해 효과가 있음을 실험적으로 확인하였다. 따라서 인디언구스베리와 님잎 추출물을 포함하는 복합 처방이 숙취 해소 기능성 식품 소재로서 활용 가능성이 충분할 것이라 사료되며, 아울러 처방 구성 약물 모두 이미 식품으로 등재되어 있어 산업화 가능성이 높을 것으로 보인다.
Rat을 이용한 동물 병태 모델에서는 시간(1, 3 및 5시간) 에 따라 채취한 혈중 에탄올, alcohol dehydrogenase(ADH) 및아세트알데히드 농도의 변화를 관찰한 결과 시간 경과에 따라 대조군에 비해 혈중 에탄올과 아세트알데히드 함량은 유의적으로 감소하였고, ADH는 유의적으로 증가한 결과를 통해 본 연구에 사용한 복합 처방의 숙취제거 효능이 인정되었다. 제품의 안정성을 확인하기 위하여 AST, ALT 및 ALP 활성을 측정한 결과, ALT는 정상군, 대조군, 실험군 사이에서 차이가 나타나지 않았고 AST와 ALP 는 대조군에 비해 유의성 있는 감소가 나타난 결과로 안정성과 간 손상 억제 효과가 검증되었다.
혈액 내 아세트알데히드 함량을 분석한 결과, CP 투여군은 3 시간과 5시간 후에서 대조군에 비해 유의성 있는 (** : p<0.01, *** : p<0.001) 감소가 나타났다(Table 5)(Fig. 5).
혈액 내 알코올 탈수소효소 함량을 분석한 결과, CP 투여군은 모든 시간에서 대조군에 비해 유의성 있는 (* : p<0.05, *** : p<0.001) 증가가 나타났다(Table 4)(Fig. 4).
혈액 내 알코올 함량을 분석한 결과, CP 투여군은 모든 시간에서 대조군에 비해 유의성 있는 (*** : p<0.001) 감소가 나타났다 (Table 3)(Fig. 3).
후속연구
이상의 결과로 보아 인디언구스베리와 님잎 추추출물을 함유한 복합 처방은 숙취해소에 효과적이고 안전하게 사용될 수 있을 것으로 사료된다.
이후 3, 5시간 후에서는 아세트알데히드가 감소되었다. 이와 같은 결과를 통해 인디언 구스베리와 님잎 추출물을 함유하는 복합 처방이 ADH의 활성을 촉진시켜 혈액 중 알코올 및 아세트알데히드를 효과적으로 감소시킴으로써 숙취해소에 유용하게 활용될 수 있을 것으로 보인다.
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