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문제 정의
- 잡곡에 속하는 귀리, 수수, 율무, 기장은 전 세계적으로 재배되고 있으며, 국내에는 최근 웰빙 문화의 확산으로 잡곡의 수요가 증가하고 있고, 건강기능식품의 소재로 이용 분야가 확대되는 등 부가가치가 향상되면서 지역 농업 활성화를 위한 방안으로 잡곡 재배의 중요성은 증가하고 있다. 본 연구에서는 2017년과 2018년에 귀리, 수수, 율무, 기장의 주산지 재배포장에서 출수 후에서 수확 전까지 수집한 이삭시료의 Fusarium 독소 오염을 분석하고 중복 오염 조사를 통해 국내 잡곡의 곰팡이독소 안전관리를 위한 기초자료를 제시하고자 한다.
제안 방법
- DON, NIV, ZEA 분석은 식품공전의 DON 시험법과 ZEA 시험법을 변형하여 수행하였다 22) . DON과 NIV의 분석을 위해 시료 1 g을 10 mL의 3차 증류수를 넣은 후 1시간 동안 300 rpm으로 진탕 추출하였다(LSI-1005, Daihan scientific, Wonju, Korea).
- DON, NIV, ZEA의 분석은 Ryu 등 25) 의 분석법을 변형하여 수행하였다. UPLC (Waters Acquity UPLC ® H Class, Waters, Singapore)를 사용하여 분석하였다.
- DON과 NIV는 25 μg/mL, ZEA은 5 μg/mL 농도로 ACN 으로 용해하였으며, FB1 과 FB2 는 10 μg/mL 농도로 ACN:Water (1:1, v/v) 용매로 용해하여 제조한 다음, 0.1 mL 을 취하여 50 ℃ 조건에서 질소농축기(N-Evap 11250-RT, Organomation Assoc., Berlin, MA, USA)를 이용하여 농축하였다.
- 농축된 시료는 1 mL의 이동상 용매[DON과 NIV는 Water:ACN:MeOH (90:5:5, v/v/v), ZEA은 Water:ACN:MeOH (43:35:22, v/v/v) FB1 과 FB2 는 Water:ACN (50:50, v/v)]로 재용해하여 표준용액을 조제하였다. DON과 NIV는 50, 100, 200, 500, 1000, 2000, 2500 ng/mL, ZEA은 2, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 500 ng/mL 농도가 되도록 검량선을 작성하였으며 FB 1 과 FB 2 는 matrix matched calibration 작성을 위해 독소에 오염되지 않은 잡곡을 전처리 한 후 질소 농축된시료에 표준용액을 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1000 ng/mL 농도가 되도록 첨가하여 재용해한 시료를 이용하여 검량선을 작성하였다.
- 3 mL/min, 시료 주입량 10 μL, 분석시간 10분의 등용매조건(isocratic)으로 분석하였다. DON과 NIV의 검출은 Water:ACN:MeOH (90:5:5, v/v/v) 이동상과 흡광검출기(diode array detector, DAD, 218 nm)를 사용하여 수행하였다. ZEA 분석용 이동상은 Water:ACN:MeOH (43:35:22, v/v/v)이었고, 형광검출기(fluorescence detector, FLD, Ex=274 nm, Em=440 nm)로 검출하였다.
- 2 μm 시린지 필터로 여과하였으며 UPLC 분석을 위한 시액으로 사용하였다. FUM 분석은 QuEChERS 방법을 변형하여 수행하였다 23,24) . 분쇄 시료 1 g에 0.
- Source temperature와 desolvation temperature는 각각 150 ℃, 400 ℃, Cone과 desolvation gas의 유속은 50 L/h와 600 L/h으로 설정하였다. Mass spectrometer는 ESI positive mode로 FB 1 은 722.7, Cone (V) 56, FB 2 는 706.7, Cone (V) 50으로 설정하여 SIM mode로 분석하였다.
- Mass detector의 capillary와 extraction cone voltage는 3000 V와 50 V로 각각 설정하였다. Source temperature와 desolvation temperature는 각각 150 ℃, 400 ℃, Cone과 desolvation gas의 유속은 50 L/h와 600 L/h으로 설정하였다. Mass spectrometer는 ESI positive mode로 FB 1 은 722.
- UPLC (Waters Acquity UPLC ® H Class, Waters, Singapore)를 사용하여 분석하였다.
- 건조된 시료는 1 mL의 이동상 용액으로 재용해한 후 0.2 μm 시린지 필터로 여과한 다음 LC-MS 분석을 수행하였다.
- 본 연구는 ‘식품등 시험법 마련 표준절차에 관한 가이드라인’에 근거하여 시험법의 직선성(linearity), 정확성 (accuracy), 정밀성(precision), 검출한계(limit of detection, LOD) 및 정량한계(limit of quantitation, LOQ)에 대한 유효성을 검증하였다 26) .
- 분석 컬럼은 Acquity UPLC ® BEH C18, 1.7 μm, 2.1×100 nm (Waters, Dublin, Ireland)를 사용하였고, 유속 0.3 mL/min, 시료 주입량 10 μL, 분석시간 10분의 등용매조건(isocratic)으로 분석하였다.
- 직선성 확인을 위하여 대상 독소를 상기와 같은 방법으로 조제한 표준 용액의 농도별 각각의피크 면적을 이용하여 검량선을 작성하였고, 검량선의 결정계수(coefficient of determination, R 2 )를 구하였다. 시험법의 정확성 및 정밀성을 확인하기 위하여 독소에 오염되지 않은 귀리, 수수, 율무, 기장에 표준물질을 첨가한 후분석하여 회수율을 구하였다. 처리농도는 DON과 NIV 그리고 FB 1 과 FB 2 를 각각 100, 500, 1000 μg/kg 수준이 되도록 첨가하였으며, ZEA은 20, 50, 100 μg/kg 수준으로 첨가하여 3반복으로 수행하였다.
- 1×100 mm (Waters, Scotland, UK)를 사용하였으며 컬럼 온도는 40 ℃로 설정하였다. 이동 상으로는 0.1% formic acid 함유 물(A)과 ACN(B)을 이용 하여 다음과 같이 구배조건(gradient)으로 분석하였다(0-3분 간 20% B; 3-13분간 30% B, 13-14분에 30%-100% B, 14-15분간 100% B, 15-21분간 20% B, 총 분석시간: 21분). Mass detector의 capillary와 extraction cone voltage는 3000 V와 50 V로 각각 설정하였다.
- 혼합액 10 mL을 DON-NIV 면역친화컬럼(DONNIV TM WB, Vicam, MA, USA)에 통과시킨 후(2-3 drops/ s), 10 mL의 phosphate buffered saline (PBS; Oxioid, Hampshire, UK) 및 3차 증류수 10 mL로 세척하였다. 주사기를 이용하여 천천히 컬럼에 남아 있는 물을 제거 한 후 0.5 mL의 MeOH과 1.5 mL의 ACN을 이용하여 컬럼에 있는 독소를 용출하였다. 용출액은 50 ℃에서 질소가스로 건조하였으며 1 mL의 이동상 용액으로 재용해하였다.
- 질소 건조한 시료는 1 mL의 이동상 용액으로 재용해한 후 0.2 μm 시린지 필터로 여과하였으며 UPLC 분석을 위한 시액으로 사용하였다.
- 처리농도는 DON과 NIV 그리고 FB 1 과 FB 2 를 각각 100, 500, 1000 μg/kg 수준이 되도록 첨가하였으며, ZEA은 20, 50, 100 μg/kg 수준으로 첨가하여 3반복으로 수행하였다.
- 처리농도는 DON과 NIV 그리고 FB 1 과 FB 2 를 각각 100, 500, 1000 μg/kg 수준이 되도록 첨가하였으며, ZEA은 20, 50, 100 μg/kg 수준으로 첨가하여 3반복으로 수행하였다. 회수율 평균과 상대표준편차(relative standard deviation, RSD)를 계산하여 시험법의 정확도 및 정밀도를 평가하였다. 검출 및 정량한계는 크로마토그램 상에서 신호 대 잡음비(signal/noise ratio)를 각각 3, 10 이상으로 하였다.
대상 데이터
- 모든 시료는 자연건조 후 분쇄기(CMFP-40000, Hanil, Korea)를 이용하여 균질화하여 -20 ℃에 냉동 보관하면서 실험에 사용하였다. 2017년 수집 시료 중 일부는 샘플링 양의 부족으로 제랄레논 독소의 경우 총 216개 시료를 분석하였다(Table 1).
- 의 분석법을 참고하여 수행하였다. HPLC (Waters Corporation, e2695 separation module, Milford, MA, USA)와 Mass detector (1100 MSD, Agilent, Pal Alto, CA, USA)를 사용하였다. 분석 컬럼은 Xselect SCH C18 3.
- 시료채집 귀리, 수수, 율무, 기장의 주산지 농가에서 재배하는 밭을 중심으로 총 244개 시료를 2017년과 2018년 수집하여 Fusarium 독소 오염도를 조사하였다. 귀리는 전남 강진(39 점)과 전북 정읍(49점)에서 총 88점을 수집하였고, 수수는 충북 단양(38점), 강원 영월(19점), 경북 안동(3점)에서 총 60점을 수집하였다, 율무는 전남 화순(34점)과 전북 진안 (36점)에서 총 70점을 수집하였으며, 기장은 전남 신안(4 점)과 영광(18점), 경북 안동(1점), 제주(3점)에서 총 26점을 수집하였다. 수집 시기는 유숙기에서 수확기로 약 500 g 씩을 수집하였다.
- 시료채집 귀리, 수수, 율무, 기장의 주산지 농가에서 재배하는 밭을 중심으로 총 244개 시료를 2017년과 2018년 수집하여 Fusarium 독소 오염도를 조사하였다. 귀리는 전남 강진(39 점)과 전북 정읍(49점)에서 총 88점을 수집하였고, 수수는 충북 단양(38점), 강원 영월(19점), 경북 안동(3점)에서 총 60점을 수집하였다, 율무는 전남 화순(34점)과 전북 진안 (36점)에서 총 70점을 수집하였으며, 기장은 전남 신안(4 점)과 영광(18점), 경북 안동(1점), 제주(3점)에서 총 26점을 수집하였다.
- 추출 및 이동상 용액에 사용된 아세토니트릴(ACN)과 메탄올(MeOH)은 HPLC 급(Fisher, Darmstadt, Germany)을 사용하였다. 염화나트륨 (NaCl)과 황산나트륨(MgSO4 ), formic acid는 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구매하여 사용하였다. 물은 Millipore 사(Bedford, MA, USA)의 초순수제조장치를 이용하여 18.
- )은 Biopure (Tulln, Austria) 제품을 구입하여 사용하였다. 추출 및 이동상 용액에 사용된 아세토니트릴(ACN)과 메탄올(MeOH)은 HPLC 급(Fisher, Darmstadt, Germany)을 사용하였다. 염화나트륨 (NaCl)과 황산나트륨(MgSO4 ), formic acid는 Sigma-Aldrich (St.
- 표준물질로 사용한 데옥시니발레놀(DON), 니발레놀(NIV), 제랄레논(ZEA), 푸모니신(FB1 , FB2 )은 Biopure (Tulln, Austria) 제품을 구입하여 사용하였다. 추출 및 이동상 용액에 사용된 아세토니트릴(ACN)과 메탄올(MeOH)은 HPLC 급(Fisher, Darmstadt, Germany)을 사용하였다.
데이터처리
- . 직선성 확인을 위하여 대상 독소를 상기와 같은 방법으로 조제한 표준 용액의 농도별 각각의피크 면적을 이용하여 검량선을 작성하였고, 검량선의 결정계수(coefficient of determination, R 2 )를 구하였다. 시험법의 정확성 및 정밀성을 확인하기 위하여 독소에 오염되지 않은 귀리, 수수, 율무, 기장에 표준물질을 첨가한 후분석하여 회수율을 구하였다.
이론/모형
- FB 1 과 FB 2 의 분석은 Choi 등 23) 의 분석법을 참고하여 수행하였다. HPLC (Waters Corporation, e2695 separation module, Milford, MA, USA)와 Mass detector (1100 MSD, Agilent, Pal Alto, CA, USA)를 사용하였다.
성능/효과
- DON은 수수에서 오염률(33.3%)이 가장 높았으나, 평균 오염농도는 93.1 μg/kg로 가장 낮았다.
- 6 μg/kg로 나타났다. FUM 의 오염은 2017년 잡곡 시료에 비해 2018년 시료가 높은 경향을 나타내었으며, FB 1 은 FB 2 보다 높은 오염농도를 나타내었다. 그러나 본 연구에서 조사한 잡곡 시료의 곰팡이독소의 검출량은 수수의 ZEA을 제외하고 모두 국내 곰팡이독소 안전관리기준에서 허용하는 최대 기준치(DON: 1000 μg/kg, FUM: 4000 μg/kg) 이하 수준이었다.
- FUM은 수수 에서 가장 빈번하게 검출되었으며(71.7%) 평균 오염농도 226.8 μg/kg 최대 오염농도 1581.7 μg/kg로 오염수준이 가장 높았다.
- 매질별 독소의 회수율과 검출 및 정량한계는 Table 2에 나타내었다. 각 시료의 회수율은 귀리에서 70.9-116.1%, 수수에서 70.1-106.6%, 율무에서 68.0-103.6%, 기장에서 71.0-105.6%이었으며 상대표준편차는(RSD) 각각 1.6-18.5%, 0.4-17.2%, 1.1-18.1%, 0.1-19.7%로 적합한 수준이었다(Table 2). DON의 검출한계는 30 μg/kg, 정량한계는 90 μg/kg이었으며, NIV는 각각 20 μg/kg, 60 μg/kg를 나타내었다.
- 그러나 본 연구에서 조사한 잡곡 시료의 곰팡이독소의 검출량은 수수의 ZEA을 제외하고 모두 국내 곰팡이독소 안전관리기준에서 허용하는 최대 기준치(DON: 1000 μg/kg, FUM: 4000 μg/kg) 이하 수준이었다.
- 0%로 높았다. 두 종 이상의 독소가 검출된 시료 중 가장 빈번한 조합으로는, NIV와 ZEA의 중복 오염(26.7%)으로 가장 높았으며 그 다음으로 ZEA과 FUM (20.0%)이었다. 수수는 ZEA과 FUM이 동시에 오염된 시료가 14점(23.
- 본 연구결과 2017년과 2018년 잡곡 총 244점 시료의 Fusarium 독소를 분석한 결과 134점에서 DON, NIV, ZEA, FUM (FB 1 +FB 2 )이 한 개 이상 검출되었고 2년 평균 54.9%의 오염률을 나타내었다(Table 3). 시료별 오염률은 귀리 88점 중 29점(33.
- 본 연구에서 귀리, 수수, 율무, 기장 등 잡곡의 Fusarium 곰팡이독소 오염을 모니터링 한 결과, 개별 곰팡이독소 오염량은 수수의 ZEA을 제외하고 현행 국내 곰팡이독소 안전관리기준에서 허용하는 최대 기준치 이하로 나타났다. 그러나 곰팡이독소의 중복 오염이 빈번히 발생하고 있어, 중복 오염으로 인해 총 곰팡이독소의 일일평균섭취량이 높아질 수 있다.
- 브라질에서는 밀의 DON, NIV, ZEA 의 오염 여부를 조사한 결과, DON, ZEA, NIV 순으로 검출률이 높았으며, 평균 검출량은 DON은 1046 μg/kg, NIV 는 100 μg/kg 이하였고, ZEA은 82 μg/kg 이었다
- 0%)이었다. 수수는 ZEA과 FUM이 동시에 오염된 시료가 14점(23.3%)으로 가장 높았으며 그 다음으로 NIV, ZEA, FUM의 중복 오염 순이었다. 또한 기장 시료는 NIV와 ZEA이 중복 오염된 시료가 11점(42.
- 0%) 순서로 나타났으며 수수의 Fusarium 독소 중복 오염이 가장 높았다. 수수는 세 종 이상의 독소의 검출비율 또한 40.0%로 높았다. 두 종 이상의 독소가 검출된 시료 중 가장 빈번한 조합으로는, NIV와 ZEA의 중복 오염(26.
- 9%의 오염률을 나타내었다(Table 3). 시료별 오염률은 귀리 88점 중 29점(33.0%), 수수 60점 중 52점(86.7%), 율무 70 점 중 38점(54.3%), 기장 26점 중 15점(57.7%)이 오염된 것으로 나타나 수수, 기장, 율무, 귀리 순으로 높았다. 그러나 작물별 곰팡이독소 오염수준은 독소의 발생빈도와 다르게 나타냈다.
- 총 시료 중 Fusarium 독소가 두 종, 세 종, 네 종이 동시에 검출된 시료의 비율은 각각 17%, 10%, 3%로 나타났다. 잡곡별로 살펴보면, 두 종 이상의 독소에 오염된 시료는 수수(70.0%), 기장(38.5%), 율무(20.0%), 귀리(8.0%) 순서로 나타났으며 수수의 Fusarium 독소 중복 오염이 가장 높았다. 수수는 세 종 이상의 독소의 검출비율 또한 40.
- 잡곡의 Fusarium 곰팡이독소의 중복 오염을 조사한 결과 29.9% (73/244 점)의 잡곡 시료가 두 종 이상의 Fusarium 독소에 오염된 것으로 나타났다(Fig. 3). 총 시료 중 Fusarium 독소가 두 종, 세 종, 네 종이 동시에 검출된 시료의 비율은 각각 17%, 10%, 3%로 나타났다.
- 3). 총 시료 중 Fusarium 독소가 두 종, 세 종, 네 종이 동시에 검출된 시료의 비율은 각각 17%, 10%, 3%로 나타났다. 잡곡별로 살펴보면, 두 종 이상의 독소에 오염된 시료는 수수(70.
후속연구
- 한편, 독성 연구결과 동물세포와 인간세 포에서 곰팡이독소의 중복 오염시 독성의 길항효과 (antagonistic effect), 상가효과(additive effect) 또는 상승효과(synergy effect)를 가질 수 있는 것으로 보고되었다. 46-48) 따라서 곰팡이독소 모니터링 시 개별 독소 오염뿐만 아니라, 중복 오염 결과를 제시하는 것이 추후 위해 평가를 위한 사전자료의 제공을 위해 필요할 것으로 판단된다.
- asiaticum이 많이 발생한다고 보고되어 있다 42,43) . 따라서 NIV의 경우 향후 우리나라에서 발생할 가능성이 높으므로 안전관리 측면에서 DON과 함께 주기적인 오염 모니터링이 이루어져야 할 것으로 판단된다.
- 그러나 곰팡이독소의 중복 오염이 빈번히 발생하고 있어, 중복 오염으로 인해 총 곰팡이독소의 일일평균섭취량이 높아질 수 있다. 따라서 농산물 재배 시 붉은곰팡이병 방제 등을 통해 곰팡이독소의 발생환경을 줄이고, 저장 시건조하고 습도가 낮은 상태에서 보관하는 등 곰팡이독소를 줄일 수 있는 Good Agricultural Practices 기술을 접목하여 생산하는 것이 필요할 것으로 판단된다. 특히, 수수의 경우 잡곡 중 일일식품평균섭취량이 가장 높고 49) , 곰팡이독소의 오염률과 오염수준, 그리고 Fusarium 독소의 중복 오염률이 높기 때문에 지속적인 곰팡이독소 모니터링 및 위해평가가 이루어져야 할 것으로 판단된다.
- 따라서 농산물 재배 시 붉은곰팡이병 방제 등을 통해 곰팡이독소의 발생환경을 줄이고, 저장 시건조하고 습도가 낮은 상태에서 보관하는 등 곰팡이독소를 줄일 수 있는 Good Agricultural Practices 기술을 접목하여 생산하는 것이 필요할 것으로 판단된다. 특히, 수수의 경우 잡곡 중 일일식품평균섭취량이 가장 높고 49) , 곰팡이독소의 오염률과 오염수준, 그리고 Fusarium 독소의 중복 오염률이 높기 때문에 지속적인 곰팡이독소 모니터링 및 위해평가가 이루어져야 할 것으로 판단된다.
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