[논문]Huh7 간암세포에서 민들레 추출물의 상피간엽전환 억제를 통한 항전이 효과

윤현서; 안현; 박충무

doi:10.15268/ksim.2023.11.3.059

Huh7 간암세포에서 민들레 추출물의 상피간엽전환 억제를 통한 항전이 효과
Anti-metastatic Effect of Taraxacum Officinale Water and Ethanol Extracts Through the Regulation of Epithelial-Mesenchymal Transition in Huh7 Cells 원문보기

Journal of the Korean Society of Integrative Medicine = 대한통합의학회지, v.11 no.3, 2023년, pp.59 - 67

윤현서 (동의대학교 치위생학과) , 안현 (동의대학교 방사선학과) , 박충무 (동의대학교 임상병리학과)

Abstract ▼ AI-Helper

Purpose : Epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) is recognized as an important cellular response in metastatic proceduresand characterized by loss of cellular polarity as well as gain of mesenchymal features, which enables migration and invasion. Hepatocellular carcinoma (HCC) is one of the most common primary carcinomas in the liver and exhibits a poor prognosis due to frequent extrahepatic metastasis. Taraxacum officinale has been used for a long time in oriental medicine because of its various pharmacological activitiessuch as anti-rheumatic, anti-inflammatory, antioxidative, and anticarcinogenic activities. In this study, the anti-metastatic activity of T. officinale water extract (TOWE) and ethanol extract (TOEE) was investigated through the regulation of EMT in the Huh7 cells. Methods : The effects of TOWE and TOEE on migratory and invasive activities were investigated by wound healing and in vitro invasion assays. Western blot analysis was also applied to analyze protein expression levels associated with EMT and their upstream transcription factors in Huh7 cells. Results : TOWE and TOEE treatment potently inhibited migration and invasion of Huh7 cells compared to the untreated group. Both extracts treatment inhibited protein expression levels of N-cadherin, matrix metalloproteinase (MMP)-9, and vimentin while E-cadherin was significantly accelerated. In addition, the activated status of transcription factors, Snail, nuclear factor (NF)-κ B, and zinc finger E-box binding homeobox (ZEB)1 was also inhibited with statistical significance. In comparison to both extracts, TOEE more potently attenuated migration, invasion, and EMT markers as well as their transcription factors in Huh7 cells than TOWE, which means that TOEE might possess more functional phytochemicals than TOWE. Conclusion : Consequently, TOWE and TOEEattenuated metastatic activity of hepatocellular carcinoma through the regulation of EMT markers and their transcription factors in Huh7 cells, which means that T. officinale might be a promising strategy for a chemopreventive agent against HCC metastasis.

주제어

표/그림 (4)

그림 Fig 1. Inhibitory effect of TOWE and TOEE on wound healing in Huh7 cells
그림 Fig 2. Inhibitory effect of TOWE and TOEE on matrigel invasion in Huh7 cells
그림 Fig 3. Regulatory effect of TOWE and TOEE on the expressions of E-cadherin, N-cadherin, vimentin, and MMP-9 in Huh7 cells
그림 Fig 4. Regulatory effect of TOWE and TOEE on the expressions of transcription factors, including Snail, NF-κB, and ZEB1 in Huh7 cells

AI 본문요약
AI-Helper

문제 정의

본 연구에서는 T. officinale을 이용하여 열수 추출물(TOWE)과 에탄올 추출물(TOEE)을 준비하고, 인간 간세포암 세포주인 Huh7 세포에 대한 두 추출물의 항전이능과 기전을 비교분석함으로써, 간세포암 전이 억제에 효과적인 기능성 소재로서 민들레 추출물의 활용 가능성을 검증하고자 하였다.
악성 종양의 전이는 암세포가 보여주는 강한 운동능으로 인해 획득되는 경우가 많아 본 연구에서는 wound healing과 in vitro invasion assay를 TOWE와 TOEE의 Huh7 세포의 운동능 억제 효과를 확인하고자 하였다. 연구 결과 Huh7 세포의 운동성으로 인해 micropipet tip으로 발생한 wound healing이 시간이 경과함에 따라 많이 이루어졌으나 TOWE와 TOEE를 처리한 Huh7 세포의 운동성은 현저히 떨어져 untreated cell과 비교하였을 경우 wound healing이 제대로 이루어지지 않은 것을 확인할 수 있었다.

제안 방법

Huh7 세포를 100 ㎜ dish에 파종하고 24시간 동안 부착한 후 TOWE와 TOEE를 250, 500 ㎍/㎖의 농도로 24시간 동안 처리하여 세포내 EMT관련 단백질의 변화를 분석하였다. 시료 처리가 끝난 Huh7 세포로부터 protein lysis buffer(PRO-PREP, Intron Biotechnology, Korea)를 이용하여 단백질을 추출하였고, 농도는 Bradford법으로 결정하였다.
officinale water extract, TOWE)와 에탄올 추출물(T. officinale ethanol extract, TOEE)을 준비하고, 간세포암 세포주인 Huh7 세포에 대한 항전이능을 EMT 기전을 중심으로 분석하였다.
간질환에 효과적인 것으로 알려진 서양 민들레로부터 열수(TOWE)와 에탄올(TOEE)을 이용한 추출물을 준비하고 간세포암 세포주인 Huh7 세포의 전이 억제 효과를 EMT 기전을 중심으로 분석하였다.

데이터처리

Huh7 세포를 6-well plate에 파종하고 24시간 동안 부착한 후 10 ㎕ micropipet tip을 이용하여 plate의 바닥을 긁어 wound를 형성하였다. 그리고 TOWE와 TOEE를 500 ㎍/㎖의 농도로 24, 48시간 동안 배양하면서 시간별 세포의 이동 정도를 위상차 현미경(Eclipse TS 100, Nikon, Japan)으로 관찰하여 결과를 비교분석하였다.
실험은 3회 반복 시행한 값을 평균±표준편차(mean±SD)로 표시하였다
실험은 3회 반복 시행한 값을 평균±표준편차(mean±SD)로 표시하였다. 통계적 유의성 분석을 위하여 SPSS 프로그램(version 26.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 일원배치 분산분석법(one-way ANOVA)을 사용하였고, 사후 검증은 Duncan 방법을 이용하였으며 통계적인 유의수준은 .05로 하였다.

이론/모형

두 시료가 EMT 관련된 마커들 및 그들의 전사인자들의 발현 조절을 할 수 있는지의 여부를 Western blot으로 분석하였다. 특히, cadherin switch, vimentin, MMP-9 뿐만 아니라 이들의 발현 조절에 관여하는 Snail, NF-κB, ZEB1과 같은 전사인들의 발현을 분석한 결과 두 시료는 E-cadherin을 증가시키고 N-cadherin의 발현을 감소시켜 cadherin swith를 ‘OFF’시키려 하였고, vimentin과 MMP-9의 발현도 억제하였다.
Wound healing assay와 in vitro invasion assay의 결과를 통해 TOWE와 TOEE는 Huh7 세포가 보이는 침윤과 전이능을 억제하는 활성을 가지고 있는 것으로 판단할 수 있었다. 따라서 이러한 활성이 TOWE와 TOEE의 EMT 관련 단백질 발현 조절에 기인한 것인지를 확인하기 위하여 Huh7 세포에서 추출한 단백질을 Western blot analysis를 활용하여 분석하였다. Cadherin switch를 구성하는 E-cadherin, N-cadherin, 그리고 중간엽 줄기세포의 지표인 vimentin과 세포외기질을 분해할 수 있는 효소인 MMP-9의 발현량을 확인한 결과 Fig 3에서 보는 것과 같이 TOWE와 TOEE의 처리에 의해 E-cadherin의 발현량은 유의적으로 증가하였고, N-cadherin의 발현은 TOEE의 처리로 감소하는 결과를 보였으며, 이를 통해 TOWE와 TOEE는 cadherin switch를 ‘OFF’하는 활성을 나타내는 것을 알 수 있었다.
Huh7 세포를 100 ㎜ dish에 파종하고 24시간 동안 부착한 후 TOWE와 TOEE를 250, 500 ㎍/㎖의 농도로 24시간 동안 처리하여 세포내 EMT관련 단백질의 변화를 분석하였다. 시료 처리가 끝난 Huh7 세포로부터 protein lysis buffer(PRO-PREP, Intron Biotechnology, Korea)를 이용하여 단백질을 추출하였고, 농도는 Bradford법으로 결정하였다. 전기영동을 위한 시료의 준비는 추출된 50 ㎍의 단백질과 loading buffer인 4x laemmli buffer(Bio-Rad Laboratories, Inc.

성능/효과

Cadherin switch를 구성하는 E-cadherin, N-cadherin, 그리고 중간엽 줄기세포의 지표인 vimentin과 세포외기질을 분해할 수 있는 효소인 MMP-9의 발현량을 확인한 결과 Fig 3에서 보는 것과 같이 TOWE와 TOEE의 처리에 의해 E-cadherin의 발현량은 유의적으로 증가하였고, N-cadherin의 발현은 TOEE의 처리로 감소하는 결과를 보였으며, 이를 통해 TOWE와 TOEE는 cadherin switch를 ‘OFF’하는 활성을 나타내는 것을 알 수 있었다
Huh7 세포의 운동능에 미치는 TOWE와 TOEE의 효과를 확인하기 위하여 wound healing과 in vitro invasion assay를 시행한 결과 두 시료의 처리로 인해 Huh7 세포의 운동성은 현저히 떨어져 wound healing이 억제된 것을 볼 수 있었다. 또한 in vitro invasion assay에서도 두 시료를 처리한 세포의 membrane 투과 효과가 억제되는 것으로 보아 TOWE와 TOEE는 Huh7 세포의 운동성의 억제를 통해 전이를 조절할 수 있는 능력이 있음을 알 수 있었다.
Wound healing assay와 in vitro invasion assay의 결과를 통해 TOWE와 TOEE는 Huh7 세포가 보이는 침윤과 전이능을 억제하는 활성을 가지고 있는 것으로 판단할 수 있었다. 따라서 이러한 활성이 TOWE와 TOEE의 EMT 관련 단백질 발현 조절에 기인한 것인지를 확인하기 위하여 Huh7 세포에서 추출한 단백질을 Western blot analysis를 활용하여 분석하였다.
결론적으로 TOWE와 TOEE는 E-cadherin, N-cadherin, vimentin, MMP-9의 발현과 이들의 전사인자인 Snail, ZEB1, NF-κB의 활성을 억제하여 Huh7 세포의 전이능을 억제하는 것으로 나타났다.
그리고 전사인자인 Snail, NF-κB, ZEB1의 활성 또한 유의하게 억제하였다
연구 결과 Huh7 세포의 운동성으로 인해 micropipet tip으로 발생한 wound healing이 시간이 경과함에 따라 많이 이루어졌으나 TOWE와 TOEE를 처리한 Huh7 세포의 운동성은 현저히 떨어져 untreated cell과 비교하였을 경우 wound healing이 제대로 이루어지지 않은 것을 확인할 수 있었다. 또한 in vitro invasion assay에서도 TOWE와 TOEE를 처리한 세포의 transmembrane 효과가 untreated cell과 비교 시 현저히 떨어지는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 바탕으로 TOWE와 TOEE는 Huh7 세포의 운동성의 억제를 통해 전이를 조절할 수 있는 능력이 있음을 알 수 있었고, 두 물질 간의 비교에서는 에탄올 추출물인 TOEE가 열수 추출물인 TOWE보다 강한 활성을 보이는 것은 유기용매를 이용한 추출이 지용성 활성 성분의 추출에 유리하기 때문인 것으로 생각된다.
Huh7 세포의 운동능에 미치는 TOWE와 TOEE의 효과를 확인하기 위하여 wound healing과 in vitro invasion assay를 시행한 결과 두 시료의 처리로 인해 Huh7 세포의 운동성은 현저히 떨어져 wound healing이 억제된 것을 볼 수 있었다. 또한 in vitro invasion assay에서도 두 시료를 처리한 세포의 membrane 투과 효과가 억제되는 것으로 보아 TOWE와 TOEE는 Huh7 세포의 운동성의 억제를 통해 전이를 조절할 수 있는 능력이 있음을 알 수 있었다.
Cadherin switch를 구성하는 E-cadherin, N-cadherin, 그리고 중간엽 줄기세포의 지표인 vimentin과 세포외기질을 분해할 수 있는 효소인 MMP-9의 발현량을 확인한 결과 Fig 3에서 보는 것과 같이 TOWE와 TOEE의 처리에 의해 E-cadherin의 발현량은 유의적으로 증가하였고, N-cadherin의 발현은 TOEE의 처리로 감소하는 결과를 보였으며, 이를 통해 TOWE와 TOEE는 cadherin switch를 ‘OFF’하는 활성을 나타내는 것을 알 수 있었다. 또한 vimentin과 MMP-9의 발현 억제를 통하여 중간엽 줄기세포로의 전환을 억제하고 세포외기질의 분해 억제를 통해 종양세포의 전이를 조절할 수 있는 것으로 나타났다.
악성 종양의 전이는 암세포가 보여주는 강한 운동능으로 인해 획득되는 경우가 많아 본 연구에서는 wound healing과 in vitro invasion assay를 TOWE와 TOEE의 Huh7 세포의 운동능 억제 효과를 확인하고자 하였다. 연구 결과 Huh7 세포의 운동성으로 인해 micropipet tip으로 발생한 wound healing이 시간이 경과함에 따라 많이 이루어졌으나 TOWE와 TOEE를 처리한 Huh7 세포의 운동성은 현저히 떨어져 untreated cell과 비교하였을 경우 wound healing이 제대로 이루어지지 않은 것을 확인할 수 있었다. 또한 in vitro invasion assay에서도 TOWE와 TOEE를 처리한 세포의 transmembrane 효과가 untreated cell과 비교 시 현저히 떨어지는 것을 확인할 수 있었다.
그리고 전사인자인 Snail, NF-κB, ZEB1의 활성 또한 유의하게 억제하였다. 이 결과를 통해 TOWE와 TOEE는 Huh7 세포의 전이를 조절할 수 있음을 알 수 있었다. 더불어 TOWE와 TOEE의 활성을 비교하였을 경우, TOEE가 TOWE보다 더 강한 EMT 마커와 전사인자 억제능을 보이는 것은 유기용매가 더 많은 활성 성분을 녹일 수 있기 때문인 것으로 추측된다.
또한 in vitro invasion assay에서도 TOWE와 TOEE를 처리한 세포의 transmembrane 효과가 untreated cell과 비교 시 현저히 떨어지는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과를 바탕으로 TOWE와 TOEE는 Huh7 세포의 운동성의 억제를 통해 전이를 조절할 수 있는 능력이 있음을 알 수 있었고, 두 물질 간의 비교에서는 에탄올 추출물인 TOEE가 열수 추출물인 TOWE보다 강한 활성을 보이는 것은 유기용매를 이용한 추출이 지용성 활성 성분의 추출에 유리하기 때문인 것으로 생각된다.
특히, cadherin switch, vimentin, MMP-9 뿐만 아니라 이들의 발현 조절에 관여하는 Snail, NF-κB, ZEB1과 같은 전사인들의 발현을 분석한 결과 두 시료는 E-cadherin을 증가시키고 N-cadherin의 발현을 감소시켜 cadherin swith를 ‘OFF’시키려 하였고, vimentin과 MMP-9의 발현도 억제하였다

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표제어: PCR

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용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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