유전성대사이상 질환은 acute status로 진행되어 돌연사에 이르거나 조기진단하지 않으면 뇌에 치명적인 독성물질이 축적되어 정신박약이나 신체불구가 되는 경우가 많다. 따라서 신속 정확한 검사 및 진단을 필요로 한다. 본 연구에서는 운반 및 보관이 용이한 소변 및 혈장 여지로부터 유기산과 아미노산을 전처리하여 GC/MS-selected ion monitoring (SIM)을 이용하여 동시분석 하는 방법을 개발하였다. 소변이나 혈장여지로부터 아미노산과 유기산을 물 메탄을 혼합액으로 추출하여 유기산 정량을 위한 내부표준물질로 t
유전성대사이상 질환은 acute status로 진행되어 돌연사에 이르거나 조기진단하지 않으면 뇌에 치명적인 독성물질이 축적되어 정신박약이나 신체불구가 되는 경우가 많다. 따라서 신속 정확한 검사 및 진단을 필요로 한다. 본 연구에서는 운반 및 보관이 용이한 소변 및 혈장 여지로부터 유기산과 아미노산을 전처리하여 GC/MS-selected ion monitoring (SIM)을 이용하여 동시분석 하는 방법을 개발하였다. 소변이나 혈장여지로부터 아미노산과 유기산을 물 메탄을 혼합액으로 추출하여 유기산 정량을 위한 내부표준물질로 tropic acid를 아미노산 정량을 위한 내부표준물질로 각 아미노산의 stable isotope 혹은 norleucine을 넣고, 제단백하여 질소로 완전히 증발 건조하였다. 여기에 methyl orange를 지시약으로 첨가한 후 먼저 N-methyl-N- (trimethylsily-trifluoroacetamide)(MSTFA)를 넣어 유기산과 아미노산의 카르복실기(-COOH)에 TMS 유도체화 반응시킨 다음, N-methyl-bis-trifluoroacetamide (MBTFA)를 넣어 아미노산의 아미노기($-NH_2$)에 TFA 유도체화 반응을 시켜서 CC/MS-selected ion monitoring mode에서 분석하였다. TMS-TFA의 최적조건도 확립 되었다. 본 연구에서 개발된 스크리닝방법은 1) 여지의 사용으로 검체운반과 보관의 편리성, 2) 기존에 CC/MS를 이용한 유기산 분석과 amino acid analyzer를 이용한 아미노산의 분석으로 각각 실험하던 것을 여지로 부터 전처리하여 유기산과 아미노산을 동시 분석할 수 있다. 3)간편한 시료 전처리뿐만 아니라 총 분석 시간을 14시간에서 6시간으로 단축시킴으로서 실제 진단검사에 유용하게 응용 가능하다. 본 연구에서 개발된 방법으로 keto acid를 제외한 straight chain, branched chain, hydroxy와 phenolic 유기산 71종, glycine류 6종과 aliphatic, aromatic, hydroxy, carboxyl, amide 아미노산 13종을 선택적으로 정량할 수 있었다. 이 방법을 Propionic aciduria, Methylmalonic aciduria, Phenylketonuria, Maple syrup urine diseas, Ornitine transcarbamylase deficiency 환자의 소변과 혈장 여지에 실제로 적용시켜 나온 정량 결과를 개발한 자동화 시스템을 통하여 진단하게 한 결과 적용한 40여명을 pilot test 했을 때 환자의 여지 검체로부터 6명의 유전성 대사이상질환을 정확히 진단 가능함을 확인할 수 있었다.
Abstract▼
Early rapid diagnosis and medical intervention is critical for the treatment of patients with inborn errors of metabolism. A new trimethylsilyl (TMS) trifluoroacetyl (TFA) derivatization method of organic acids and amino acids was developed for the rapid screening of inherited metabolic disorders fr
Early rapid diagnosis and medical intervention is critical for the treatment of patients with inborn errors of metabolism. A new trimethylsilyl (TMS) trifluoroacetyl (TFA) derivatization method of organic acids and amino acids was developed for the rapid screening of inherited metabolic disorders from filter paper specimens by GC/MS selective ion monitoring (SIM). Filter paper urine or plasma specimen with internal standard (tropate) were dried under the nitrogen after preparing with mixture of distilled water and methanol. And then methyl orange was added to the residue as an indicator reagent. For silyl derivative of carboxylic functional group, N-methyl-N-(trimethylsilyl-trifluoroacetamide) was added and heated for 10 - 20 min at $50\;-\;70^{\circ}C$. For trifluoroacetyl derivatives for amino functional group, N-methyl-bis-trifluoroacetamide were added and heated for 10 - 20 min at $50\;-\;70^{\circ}C$. Both reaction was consecutively performed at optimum condition for TMS-TFA derivatives. The final TMS-TFA derivatives was introduced into the GC/MS. Specific target ions for quantification and identification was chosen over 71 organic acids, 6 glycines and 12 amino acids for CC/MS - SIM. We successfully analyzed total of 90 compounds including aliphatic, aromatic, hydroxy, carboxyl, amide amino acids, and straight chain, branched chain, hydroxy, and phenolic organic acids except for koto- acids. Quantification result was released and transfered to the automated interpretive report system using Excel macro file using personal computer. The advantage of our method is , 1) ease of delivery and storage of specimens onto the filter paper, 2) a shortening of sample preparation and analytical time when compared to the conventional two separate methods, amino acid analyzer for amino acid analysis and CC-MS for organic acid analysis, and 3) simple, rapid and simultaneous derivatization. Whereas tile method showed disadvantage that citullinemia, one of the urea cycle disorders is not able to be screened. The developed method was practically applied for determining the usefulness from specimens with confirmed metabolic diseases such as Propionic aciduria, Methylmalonic aciduria, Phenylketonuria, Ornitine transcarbamylase deficiency and Maple syrup urine disease. Thus, we confirmed that the metabolic disorders were correctly diagnosed through the automated interpretive diagnostic system after simultaneous derivatization of organica and amino acids. Also the new method can provide substantial benefit to newborns or children under suspician of metabolic disorders, if diagnosed early in life for favorable treatment and outcome.
목차 Contents
I. 연구개발결과 요약문...9
(한글) 유전성 대사이상 질환의 새로운 진단법 개발에 관한 연구...11
(영문) Development of a new diagnostic method for inherited metabolic disease...12
II. 총괄연구개발과제 연구결과...13
1. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 목표...15
1.1 최종 연구개발 목표...17
1.2 연구개발의 배경...17
1.3 연구개발의 목적 및 필요성...19
1.4 연구개발 범위...19
2. 총괄연구개발과제의 최종 연구개발 내용 및 결과...21
2.1 주요 원리...23
2.2 실험부...24
2.2.1 시약 및 표준액 제조...24
2.2.2 기기...25
2.2.3 유기산과 아미노산 표준품을 다양한 유도체화 방법의 검토...25
2.2.4 시료 전처리법 개발...27
2.2.5 새로운 분석법의 개발...28
2.2.5.1 유기산 분석법 개발 - isotope-dilution GC/MS...28
2.2.5.2 linear dynamic range 및 검출한계 정량한계 설정...29
2.2.5.3 혈장 및 소변으로 정도관리 물질의 제작 및 농도범위 설정...29
2.2.5.4 혈액여지의 소변으로 회수율 검토 및 정밀도(precision)와 정확도(accuracy) 설정...29
2.2.5.5 연령별 혈장 및 소변의 아미노산과 유기산의 참고치(reference range) 설정...29
2.2.5.6 TMS-TFA를 이용한 GC/MS library 제작...29
2.2.6 개인용 PC를 이용한 결과 정량 및 해석의 자동화 시스템 개발...29
2.2.7 대조군과 환자군에 대한 실제 검체의 적용...30
2.3 연구개발과제의 결과...30
2.3.1 Method A,B,C와 D의 비교 예비실험 결과...30
2.3.2 taget 아미노산과 유기산의 동시분석을 위한 주요 파라미터 수집...30
2.3.3 linear dynamic range 및 검출한계 정량한계 설정...39
2.3.4 소변과 혈장에서의 정도관리 물질의 제작 및 재？q성 검토...39
2.3.5 표준품의 회수율 검토 및 precision anf accuracy...57
2.3.6 연령별 혈장 및 소변에서의 참고치(reference range)설정...57
2.3.7 GC/MS library 제작...57
2.3.8 개인용 PC르 이용한 결과 자동화 시스템 개발...57
2.3.9 확진된 유전성 대사이상질환 검체로의 적용...57
3. 총괄연구개발과제의 연구결과 고찰 및 결론...101
4. 총괄연구개발과제의 연구성과 및 목표달성도...107
5. 총괄연구개발과제의 활용계획...111
6. 첨부서류...115
7. 참고문헌...119
별첨목록...129
별첨 1. Calibration curve of 90 oranic acids, amino acids and glycines...131
별첨 2. Mass spectra of 90 oranic acids, amino acids and glycines...179
별첨 3. Library matching system of mass spectrum...275
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