초록 ▼

○ 연구결과
1. 뱀무 추출물을 이용한 항비만 및 항염증 효과를 가지는 기능성 식품소재 개발
뱀무(Geum japonicum THUNBERG)의 분획물 중 에칠아세테이트 분획은 지방세포 분화 억제 작용을 나타내고, 특히 지방의 축적 과정을 조절하는 GPDH 활성과 Trigliceride 축적을 저해하여 미성숙 지방 세포의 지방화 작용을 차단함으로써 항비만 효과를 나타내며,TNF-α, IL-1β 등과 같은 초기 염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)과 산화질소(NO)의 생성억제를 유도함으로서 항염

○ 연구결과
1. 뱀무 추출물을 이용한 항비만 및 항염증 효과를 가지는 기능성 식품소재 개발
뱀무(Geum japonicum THUNBERG)의 분획물 중 에칠아세테이트 분획은 지방세포 분화 억제 작용을 나타내고, 특히 지방의 축적 과정을 조절하는 GPDH 활성과 Trigliceride 축적을 저해하여 미성숙 지방 세포의 지방화 작용을 차단함으로써 항비만 효과를 나타내며,TNF-α, IL-1β 등과 같은 초기 염증성 사이토카인(pro-inflammatory cytokine)과 산화질소(NO)의 생성억제를 유도함으로서 항염증 효과를 나타낸다. 따라서 이를 이용한 항비만 및 항염증 효능이 있는 식품 및 의료용 소재로 개발가능성이 있었다. 이 결과는 특허등록이 결정되었다.
2. 항산화, 항지방화 및 항비만 효과가 있는 배암차즈기 추출물 개발
배암차즈기에서 항산화, 항지방화 활성 물질을 탐색, 분리하여 추출물 특성과 기능을 규명함으로서 인체 내에서 활성산소의 제거, 지방의 합성과 축적을 저해하여 항비만 활성 효과를 갖는 배암차즈기 추출물의 조제방법 및 용도를 개발하였다. 따라서 이를 이용한 항비만 및 항산화 효능이 있는 식품 및 의료용 소재로 개발 가능성이 있었다. 이 결과는 특허출원하여 현재 심사 중이다.
3. 뱀무 추출물 및 분획물을 함유하는 동맥경화증의 예방 또는 치료용 조성물 개발
뱀무(Geum japonicum THUNBERG)의 에칠아세테이트 가용 추출물과 유효성분인 3,4,5-trihydroxybenzealdehyde가 동맥경화 또는 혈관계 질환의 예방 효과가 있음을 구명하였다. 3주령 Sprague-Dawley 종 숫컷 흰쥐을 고지방 식이로 사육하면서 뱀무의 에칠아세테이트 가용 추출물과 유효성분인 3,4,5-trihydroxybenzealdehyde 급이시 혈중 고밀도 콜레스테롤(HDL-cholesterol)의 수준을 높여주고 중성 지방의 함량을 감소시켜 주었다. 또한, 뱀무 추출물에서 분리한 3,4,5-trihydroxybenzaldehyde는 사람 동맥평활근 세포(HASMC)에 대한 독성은 미약하였으며, 사람 동맥평활근 세포(HASMC)가 생성하는 MMP-9(Matrix metalloproteinase)의 활성을 억제하고 TNF-α에 의해 유도되는 동맥평활근세포의 이주능을 억제하여 줌으로서 동맥경화 및 혈관계 질환을 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다. 따라서 고지혈증 및 동맥경화증, 협심증, 고혈압, 혈관종, 동맥경화증 예방 효과를 가지는 뱀무 추출물 또는 유효성분을 특허출원 하였다.
4. 뱀무와 배암차즈기에서 생리활성물질의 분리 및 동정
배암차즈기 추출액의 에칠아세테이트 분획을 칼럼크로마토그래피와 HPLC 등으로 항산화활성이 있는 물질 3종을 분리하여 1H NMR, 13C NMR 등으로 구조를 분석한 결과 rosmarinic acid, luteolin 7-O-β-glucopyranoside, hispidulin 7-O-glucopyranoside로 동정되었다. 이 중 rosmarinic acid의 항산화활성이 가장 높았다.
뱀무 (Geum japonicum THUNBERG)의 용매 분획물 중 ethylacetate (EtOAc) 분획물을 silicagel column chromatography 등으로 활성물질을 분리하였다. 분리된 화합물들을 LC/MS/MS와 NMR로 구조분석을 하여 3,4,5-trihydroxy- benzaldehyde, 6,7-dihydroxy-2H-chromen-2-one과 6,8-dihydroxy-2-oxo-2H-chromene-4- carbaldehyde로 동정하였다.
5. 뱀무 및 배암차즈기 재배방법 확립
뱀무와 배암차즈기를 지역별로 자생지의 토양, 고도 등의 환경과 생육상태를 조사하였으며, 수집된 식물체는 경남 함양군 안의면 소재 약초시험포장에 이식하여 생육상황을 조사하였다. 선발된 자생종을 이용하여 파종기와 재식거리를 시험한 결과, 배암차즈기는 파종기는 4월11일. 재식거리는 30*20 cm로 재배하는 것이 가장 최적 재배방법이었으며, 뱀무는 파종기는 4월20일. 재식거리는 40*30 cm로 재배하는 것이 가장 생육상황이 좋았다.

Abstract ▼

Ⅳ. Results and Recommendation
1. Development of the anti-obesity and anti-inflammatory
functional medicinal food materials using G. japonicumin Anti-obesity and anti-inflammatory activities of G. japonicum and Salvia plebeia that have not been experimented before were examined and methanol ext

Ⅳ. Results and Recommendation
1. Development of the anti-obesity and anti-inflammatory
functional medicinal food materials using G. japonicumin Anti-obesity and anti-inflammatory activities of G. japonicum and Salvia plebeia that have not been experimented before were examined and methanol extracts from G. japonicum and Salvia plebeia. Various fractions of methanol extract was separated and examined physiological active substances and verified of antioxidant activity. The murine 3T3-L1 preadipocyte cell line represents one of the most characterized in vitro models currently used to study adipocyte differentiation. The activities of glycerolphosphate dehydrogenase(GPDH), and accumulation of TG, markers of adipose differentiation, was affected by the extracts of G. japonicum. The ethyl acetate fraction of G. japonicum methanol extract(EFGJ) showed a remarkable scavenging activity on the 1,1-diphenyl-2 picrylhydrazyl radical. These results suggest that extracts of G. japonicum may have an inhibitory role on the early stage of 3T3-L1 cell differentiation and may be useful source as natural antioxidants. We investigate the antiinflammatory action of extracts from G. japonicum. G. japonicum, a potent antitumor agent with anti-inflammatory and antioxidant properties, inhibited NO generation, TNF-alpha, and IL-1β as pro-inflammatory cytokine. Therfore, G. japonicum supplementation is beneficial for the suppression of adipocyte differentiation, anti-inflammatory and antioxidant properties,
2. Development of the antioxidant, anti-lipidemia, and anti-obesity functional extracts using Salvia plebeia
Antioxidant, anti-lipidemia, and anti-obesity activities of Salvia plebeia that have not been experimented before were examined and methanol extracts from Salvia plebeia. Various fractions of methanol extract was separated and examined physiological active substances and verified of antioxidant activity. The murine 3T3-L1 preadipocyte cell line represents one of the most characterized in vitro models currently used to study adipocyte differentiation. The activities of glycerolphosphate dehydrogenase(GPDH), and accumulation of TG, markers of adipose differentiation, was affected by the extracts of Salvia plebeia. The ethyl acetate fraction of Salvia plebeia methanol extract showed a remarkable scavenging activity on the 1,1-diphenyl-2 picrylhydrazyl radical. These results suggest that extracts of Salvia plebeia may have an inhibitory role on the early stage of 3T3-L1 cell differentiation and may be useful source as natural antioxidants. Therfore, Salvia plebeia supplementation is beneficial for the suppression of adipocyte differentiation, and antioxidant properties,
3. Development of the anti-atherosclerosis functional medicinal food materials using G. japonicumin
Anti-atherosclerosis activities of G. japonicum were examined using methanol extracts and ethylacetate fractions from G. japonicum. The antioxidative active compound of G. japonicum was isolated and identified as 3,4,5-trihydroxybenzealdehyde. To determine whether the 3,4,5-trihydroxybenzealdehyde may have the hyoplipidemic effects, 4 wk old Sprague Dawley male rats fed high fat diet for 6 wks to induce obesity, and subsequently orally fed 3,4,5-trihydroxybenzealdehyde for further 4 wk. Supplementation with 3,4,5-trihydroxy- benzealdehyde resulted in a significant reduction of body weight gain and visceral fat mass. Adipocyte cell size was significantly reduced by 3,4,5-trihydroxybenzealdehyde. Serum triglyceride and leptin level was significantly reduced and serum HDL-cholesterol level was significantly increased by 3,4,5-trihydroxybenzealdehyde. The present results suggest that 3,4,5-trihydroxybenzealdehyde supplementation is beneficial for the suppression of diet-induced obesity and hyperlipidemia. These results suggest that 3,4,5-trihydroxybenzealdehyde may have an inhibitory role in the HASMC Toxicity and inhibition effect of MMP-9 matrigel migration from TNF-alpha and may be useful source as natural anti-atherosclerosis. Therfore, 3,4,5-trihydroxybenzealdehyde supplementation is beneficial for the suppression of hyperlipidemia, atherosclerosis, heart attack, Cardiovascular ischemia, hypertension, anemia, paralysis, and head ache.
4. Separation of Physiological Active Substances of Geum japonicum and Salvia plebeia The antioxidative compounds and antioxidant contents of G.
japonicum were determined. Substances reextracted using ethylacetate from crude methanol extract of fresh G. japonicum were separated through thin layer chromatography. Ten phenolic antioxidative bands were visualized through color reactions using ferric chloride-potassium ferriccyanide and 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH). Extract from G. japonicum(Bammu in Korean) were analyzed for their antioxidative activities and scavenging effects of free radicals. The ethyl acetate fraction of G. japonicum methanol extract showed a remarkable scavenging activity on the 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) radical.
The methanol extract of G. japonicum did not show mutagenicity as revealed through SOS chromotest. Based on the results, the extracts of G. japonicum may be useful source as natural antioxidants.
The antioxidative compounds were purified through preparative TLC and high performance liquid chromatography(HPLC), among which, three antioxidants were identified as G. japonicum on the basis of their molecular weights determined through LC/MS, 1H NMR, and 13C NMR. Three active compounds are rosmarinic acid, luteolin 7-O-β -glucopyranoside, and hispidulin 7-O-glucopyranoside, rosmarinic acid was very active compound. The Ethyl acetate fraction of G. japonicum methanol extract was separated to five Fractions(Ⅰ～Ⅴ) by silica gel column chromatography and TLC patterning. Four of them (FractionⅠ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅴ)was reseparated by silica gel column chromatography,
Sephadex LH-20 column chromatography, and Shimadzu preparative HPLC. Finally three single compounds were isolated and anlayzed by LC/MS/MS and NMR. The active substance was 3,4,5-trihydroxybenzaldehyde, 6,7-dihydroxy-2H-chromen-2-one, and 6,8-dihydroxy-2-oxo-2H-chromene-4-carbaldehyde. The most active compound was 3,4,5-trihydroxybenzaldehyde, and also have antioxidant, anti-obesity, and anti-artherosclerosis effect. The structure of 6,8-dihydroxy-2-oxo-2H-chromene-4-carbaldehyde was not confirmed, so further examination was needed.
5. Study of Materials for Functional Food
In order to characterize the extracts and THBA(3,4,5-trihydroxybenzaldehyde), HPLC and heat stability and preserve stability were examined.
These results suggest that extracts of G. japonicum may have an inhibitory role on the early stage of 3T3-L1 cell differentiationand may be useful source as natural antioxidants. Therefore, the results obtained from this study provide an alternative protective mechanism of ethyl acetate fraction of G. japonicum and provide information on the potential use of ethyl acetate fraction of G. japonicumin chemoprevention or it pathogenic conditions related to overproduction of NO and PGE2. Ethyl acetate fraction of G. japonicum methanol extract also showed excellent antioxidative activity on linoleic acid during long-period storage and on rat liver microsome peroxidation system, and good anti-peroxidation effect on lipid in Rancimat system using lard, palmoil, and perilla oil, as comared with BHT and alphatocopherol.
However, the mechanism of the inflammatory effect must be evaluated through various parameters for induction of NO production.
The present results suggest that G. japonicum supplementation is beneficial for the suppression of diet-induced obesity, hyperlipidemia, antioxidant, anti-inflammation, and anti-atheroscerolsis, further research was needed for the individualized recognition of the functional food and agricultural good products.

목차 Contents

• 제출문 ... 1
• 요약문 ... 2
• SUMMARY ... 9
• Contents ... 16
• 목차 ... 24
• 제 1 장 연구개발과제의 개요 ... 31
• 제 1 절 연구개발의 목적 및 필요성 ... 31
• 1. 연구개발의 목적 ... 31
• 2. 연구개발의 필요성 ... 31
• 제 2 절 연구개발과제의 범위 ... 34
• 제 3 절 활용방안 및 전망 ... 35
• 제 2 장 국내외 기술개발 현황 ... 36
• 제 1 절 국외 기술개발 현황 ... 36
• 제 2 절 국내 기술개발 현황 ... 38
• 제 3 장 연구개발 수행내용 및 결과 ... 40
• 제 1 절 연구수행 방법 ... 40
• 1. 뱀무 및 배암차즈기에서 기능성물질 분리 및 동정 ... 40
• 가. 식물 재료의 확보 ... 40
• 나. 기능성물질 분리 및 동정 ... 40
• 1) 공시 재료 ... 40
• 2) 시약 및 기기 ... 42
• 3) 뱀무 (Geum japonicum THUNBERG)의 항산화활성 물질 분리 및 동정 ... 42
• 4) 배암차즈기에서 항산화 활성물질의 분리 및 동정 ... 43
• 5) 항산화활성 검정 ... 43
• 2. 뱀무 및 배암차즈기 추출물 및 유효성분에 대한 생리활성 검정 ... 46
• 가. 뱀무 및 배암차즈기 추출액의 용매분획별 면역세포에 대한 활성 분석 ... 47
• 1) Nitrite Quantification ... 47
• 2) Measurement of cytokine production ... 47
• 3) Cell Viability 측정 ... 47
• 나. 세포사멸 효과 ... 47
• 1) MTT assay ... 47
• 2) SRB Assay ... 48
• 3) Cox2 promoter assay ... 48
• 다. 3T3-L1 세포에서 지방화 억제 효과 ... 48
• 1) 3T3-L1 cell culture ... 48
• 2) Triglyceride accumulation 측정 ... 48
• 3) Glycerol-3-phosphate dehydrogenase (GPDH) activity 측정 ... 48
• 4) Oil red O staining ... 48
• 라. 실험동물을을 이용한 뱀무 및 배암차즈기 추출물 및 유효성분에 대한 생리활성 검정 ... 49
• 1) 실험동물의 사육 및 식이 ... 49
• 2) 시료수집 ... 50
• 3) 지방 세포 크기 측정 ... 50
• 4) 혈중 지질 분석 ... 50
• 5) 혈중 렙틴 함량 분석 ... 50
• 6) Uncoupling protein m-RNA 분석 ... 51
• 7) 자료의 처리 ... 51
• 마. 뱀무 추출물의 동맥경화 예방효과 검정 ... 52
• 1) 세포배양 ... 52
• 2) 세포독성 검정 ... 52
• 3) 사람동맥평활근 세포(HASMC)가 생성하는 MMP-9의 저해력 검정 ... 52
• 4) 동맥평활근 세포의 이주능 실험 ... 53
• 바. 실험동물을 이용한 뱀무 추출물의 에너지소비 증진 효과 검정 ... 54
• 1) 실험동물의 사육 및 식이 ... 54
• 2) 시료수집 ... 54
• 3) 지방 세포 크기 측정 ... 55
• 4) 혈중 지질 분석 ... 55
• 5) 혈중 렙틴 함량 분석 ... 55
• 6) Uncoupling protein m-RNA 분석 ... 55
• 7) 식이섭취관련 유전자 분석 ... 56
• 8) 자료의 처리 ... 56
• 3. 기능성 식품 소재화를 위한 응용기술 연구 ... 56
• 가. 뱀무 생리활성 물질의 최적 추출 방법 ... 56
• 1) 메탄올 농도별 추출과 sonication에 의한 추출 효과 ... 56
• 2) 주정농도별 추출효율 ... 57
• 3) Hexane처리 후 주정 추출 효율 ... 57
• 4) 뱀무의 THBA 분석 방법 ... 57
• 5) LC-MS/MS 분석 ... 57
• 나. 뱀무 추출물의 저장 안전성 조사 ... 58
• 1) pH 안정성 ... 58
• 2) 온도 안정성 ... 58
• 다. ICR계 마우스에 대한 뱀무추출물의 급성 경구 독성시험 ... 58
• 1) 시험물질 및 실험동물 ... 58
• 2) 투여량 및 시험군의 구성 ... 59
• 3) 시험물질의 조제 및 투여 ... 59
• 4) 관찰 및 검사항목 ... 59
• (1) 일반증상 및 사망동물의 관찰 ... 59
• (2) 체중측정 ... 60
• (3) 부검소견 ... 60
• 5) 통계 처리 ... 60
• 라. 뱀무 추출물의 SD계 흰쥐에 대한 아급성 경구독성 시험 ... 60
• 1) 시험물질 및 실험동물 ... 60
• 2) 투여량 및 시험군의 구성 ... 61
• 3) 시험물질의 조제 및 투여 ... 61
• 4) 관찰 및 검사항목 ... 61
• (가) 일반증상 및 사망동물의 관찰 ... 61
• (나) 체중측정 ... 61
• (다) 혈액학적 및 혈액생화학적 검사 ... 62
• (라) 육안소견 및 장기 중량 ... 62
• 5) 통계 처리 ... 62
• 4. 뱀무 및 배암차즈기 안전 생산기술 개발 ... 62
• 가. 시료의 수집, 생육지 환경 및 이식후 생육상황 조사 ... 62
• 나. 재배방법 시험 ... 62
• 다. 뱀무 생육시기별 주 생리활성 물질의 함량 변화 ... 63
• 1) 뱀무 생육시기별 THBA와 phenol 함량 분석 ... 63
• 2) 뱀무 부위별 무기성분, phenol 화합물 함량 및 THBA 함량 분석 ... 63
• 제 2 절 결과 및 고찰 ... 63
• 1. 메탄올 추출액 및 용매분획에 대한 항산화 활성 검정 ... 63
• 가. DPPH방법에 의한 radical 소거능 ... 63
• 나. Ferric reducing antioxidant power (FRAP) assay ... 64
• 다. Hydroxyl radical 소거 활성 ... 64
• 라. Linoleic acid 및 유지류에 대한 항산화 활성 ... 66
• 마. Folin & Dennis법에 의한 총 페놀함량 ... 68
• 2. 배암차즈기 및 뱀무의 생리활성 물질 분리 ... 68
• 가. Ethyl acetate 분획에서 항산화성 물질의 확인 ... 68
• 나. 뱀무에서 분리된 활성물질의 구조분석 및 동정 ... 69
• 1) compound 2의 구조분석 ... 69
• 2) compound 3의 구조분석 ... 71
• 3) compound 1의 구조분석 ... 74
• 다. 배암차즈기에서 분리된 활성물질의 구조분석 및 동정 ... 78
• 라. 뱀무 및 배암차즈기에서 분리된 활성물질의 TLC 및 항산화활성 ... 80
• 3. 뱀무 및 배암차즈기 추출물 및 유효성분에 대한 생리활성 검정 ... 81
• 가. 뱀무와 배암차즈기의 항염증 활성 ... 81
• 1) Nitrite 정량과 활성 측정 ... 81
• 2) MTT assay ... 82
• 나. 뱀무와 배암차즈기의 세포사멸 효과 결과 ... 83
• 1) SRB평가법에 의한 Cytotoxicity 검정 ... 83
• 2) Hexane 분획별의 Cytotoxicity 검정 ... 85
• 3) Cox2 promoter assay ... 87
• 다. 뱀무와 배암차즈기 분획물의 지방합성 억제효과 ... 87
• 1) 뱀무의 Triglyceride accumulation 저해 효과 ... 87
• 2) 뱀무의 GPDH activity 활성 ... 88
• 3) 배암차즈기의 Triglyceride 축적저해 효과 ... 89
• 4) 배암차즈기의 GPDH activity ... 90
• 라. 실험동물을을 이용한 뱀무 및 배암차즈기 추출물 및 유효성분에 대한 생리활성 검정 ... 91
• 1) 식이 섭취, 체중 증가량 및 식이효율 ... 91
• 2) 지방 조직의 무게 ... 91
• 3) 지방 세포의 크기 ... 92
• 4) 혈중 지질 함량 ... 93
• 5) 혈중 렙틴 함량 ... 94
• 6) Adiponectin 발현 ... 94
• 7) UCP mRNA 발현 ... 96
• 마. 뱀무에서 분리한 THBA 화합물의 동맥경화 예방 효과 ... 96
• 1) 사람 동맥평활근 세포(HASMC)에 대한 독성 ... 96
• 2) MMP-9 저해 활성 및 세포의 이주능 ... 97
• 바. 실험동물을 이용한 뱀무 추출물의 에너지소비 증진 효과 검정 ... 99
• 1) 식이 섭취, 체중 증가량 및 식이효율 ... 99
• 2) 지방 조직의 무게 ... 100
• 3) 지방 세포의 크기 ... 101
• 4) 혈중 지질 함량 ... 101
• 5) 혈중 렙틴 함량 ... 103
• 6) Adiponectin 발현 ... 103
• 7) UCP mRNA 발현 ... 104
• 8) NPY 발현 ... 104
• 4. 기능성 식품 소재화를 위한 응용기술 연구 ... 106
• 가. 뱀무 생리활성 물질의 최적 추출 방법 ... 106
• 1) 메탄올 농도별 추출과 sonication에 의한 추출 효과 ... 106
• 2) 주정 농도별 추출효율 ... 107
• 3) Hexane처리 후 주정 추출 효율 ... 107
• 나. 뱀무 추출물의 저장 안전성 조사 ... 108
• 1) pH별 안정성 ... 108
• 2) 온도 안정성 ... 109
• 다. ICR계 마우스에 대한 뱀무추출물의 급성 경구 독성시험 ... 112
• 1) 폐사율 ... 112
• 2) 체중변화 ... 113
• 3) 일반증상 ... 113
• 4) 육안적 해부소견 ... 114
• 5) 결론 ... 114
• 라. 뱀무 추출물의 SD계 흰쥐에 대한 아급성 경구독성 시험 ... 115
• 1) 일반증상 및 사망동물 ... 115
• 2) 체중변화 ... 115
• 3) 혈액생화학적 검사 ... 116
• 4) 혈액학적 검사 ... 116
• 5) 육안소견 및 장기중량의 변화 ... 117
• 6) 결 론 ... 118
• 5. 뱀무 및 배암차즈기 안전 생산기술 개발 ... 118
• 가. 배암차즈기 유전자원 수집 및 특성 평가 ... 118
• 나. 뱀무 유전자원 수집 및 특성 평가 ... 124
• 다. 뱀무 및 배암차즈기 재배방법 ... 126
• 1) 배암차즈기 재배방법 ... 126
• 2) 뱀무 재배방법 ... 126
• 라. 뱀무 생육시기별 주 생리활성 물질의 함량 변화 ... 128
• 1) 뱀무 생육 시기별 THBA와 phenol 화합물 함량 ... 128
• 2) 뱀무 부위별 무기성분, phenol 및 THBA 함량 ... 128
• 제 4 장 목표달성도 및 관련분야에의 기여도 ... 130
• 제 5 장 연구개발결과의 활용계획 ... 132
• 제 6 장 연구개발과정에서 수집한 해외과학기술정보 ... 133
• 1. 식물생성 폴리페놀화합물의 최근 연구동향 ... 133
• 제 7 장 참고문헌 ... 142
• 끝페이지 ... 148