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문제 정의
- 11, 14, 15, 24, 28, 29). 본 연구에서는 세포주기 중에서도 특히 G1 과 S기의 경계의 SIART의 조절 기작에 주목하여, 이 시기에 작용하는 유전자의 변이주를 동정하고 분석하는데 중점을 두었다. 변이주의 동정에 사용된 항곰팡이성 약제인 CPO는 포유동물 세포인 HeLa 세포에서 G1 동조화를 유도한다고 보고되었으며(32), 본 연구에서 출아효모에서도 G1 arrest 효과가 나타남을 알 수 있었다.
제안 방법
- 0) 1ml에 균주를 현탁한 후, 1 plate당 200〜300개 정도의 콜로니가 나올 수 있도록 희석(10-4, 10 5)시킨 뒤 YPD 배지에 도말하였다. 각 배지는 25"C에서 3〜4일간 배양시킨 후 콜로니를 계수하여 생존율을 조사하였다(2).
- 1 M 농도의 stock solution을 만들었다. CPO 첨가 배지는 YPD 배지 혹은 선택배지인 SC-Leucine(0.67% yeast nitrogen base, 2% glucose, 2% agar) 배지를 멸균하여 약 50°C 정도로 식힌 후, 각 배지에 다양한 농도로 첨가하여 만들었다. 그리고 돌연변이화에 이용된 MNNG (N-methyl-N'-nitro-N- nitrosoguanidineGHsNQ])는 메탄올에 녹여 10 ㎍/ml인 stock solution을 만들어 희석하여 사용하였고, MMS(methylmethane sulfonate)와 HU(hydroxyurea: Sigma, co.
- 분리된 각 변이주가 세포 주기의 어느 시점에서 결손을 보이는지를 알아보기 위해 MMS. HU에 대한 감수성을 조사하였고, 유전학적 실험에 이용하기 위해 이배체(diploid)를 제작하여 변이주의 우 . 열성 변이와 포자형성률을 조사하고, 사분체 분석을 이용하여 포자의 생존율을 조사하였다.
- 먼저 변이주들을 분리하기 위해, 야생형 균주인 W303A와 W303B에 임의 돌연변이화를 수행하였다. MNNCG를 돌연변이원으로 사용하여 야생주의 생존율을 조사하여 Fig. 1에 나타내었다. 이 중 생존률이 70% 정도를 나타내는 MNNG 농도인 3 ㎍/ml을 처리 농도로 결정했다.
- W3O3A 균주를 하룻밤 배양하여 2X 1()8 cells/ml로 준비하여 CPO 농도 0, 150, 160, 17(), 180, 19(), 200, 210, 220 μM의 YPD+CPO 배지에 200μl씩 도말한 후, 30℃에서 3〜4일간 배양하였다. 이 배지에서의 야생주 W3O3A의 생존율을 조사하여 생존에 영향을 미치지 않는 최대 농도를 CPO 감수성 변이 주의 분리 농도로 결정하였다.
- YPD+MMS 배지는 YPD 고체배지에 MMS를 0, 0.005, 0.01, 0.015, 0.02%의 농도로 첨가하여 만들었고, YPD+HU 배지는 HU 농도가 각각 0, 50, 100 mM이 함유되도록 첨가하였다. 야생 주 W303A와 각 변이주를 2 ml의 YPD 액체배지에 접종하여 25℃에서 진탕 배양하여 1X107 cells/ml 세포수로 배양한 후, 균주를 (5X106)X5°, 5— 5~\ 5~3 cells/mi로 단계적으로 희석하여 준비하고, 그것을 위의 농도로 준비된 YPD+MMS 배지와 YPD + HU 배지에 streaking 및 spotting하여 3~4일간 배양한 후 감수성을 비교 조사하였다.
- 각 변이주들의 세포주기에서의 결손을 조사하기 위하여, 먼저 MMS와 HU와 같은 DNA 상해제를 야생주에서 영향을 나타내지 않는 낮은 농도로 처리하여 checkpoint의 기능을 조사하였다. 이러한 조건에서 야생형은 약제에 의해 손상된 DNA를 회복한 후 다시 세포주기가 진행되므로 시간의 지연은 다소 보여지나 상해가 회복되어 생존율에는 영향을 나타내지 않는다.
- 37℃에서 3〜4일간 배양하였다. 각 온도에서 배양된 YPD+CPO plate와 처음 plate를 비교하여, YPD plate에는 생존하나 YPD+CPO plate에는 생존하지 않는 콜로니를 CPO 감수성 변이주 (CPO sensitive mutant)로서 분리하였다. 또한 온도에 대한 감수성으로는 37℃의 YPD+CPO plate에서 생존하지 않은 콜로니를 ts-CPO 감수성 변이주로서, 16℃의 YPD+CPO plate에서 생존하지 않은 콜로니를 cs-CPO 감수성 변이주로 분리하였다.
- 각 이배체들의 포자 형성율을 조사하기 위해 포자형성배지에 patch하여 감수분열을 유도하여 포자를 형성시킨 뒤 현미경 하에서 관찰하였다(Fig. 8). 그 결과 야생주는 59.
- 이에 비해 DNA 회복기작은 정상이나 세포주기의 진행에 결손을 갖는 checkpoint에 관련된 변이주들은 상해 받은 DNA가 완전히 회복될 때까지 세포주기를 멈추지 못하여 DNA 상해를 조금 남긴 채로 세포주기의 다음 단계로 진행하여 MMS에 대해 약한 감수성을 보여주는 것으로 보고되고 있다(1, 3, 11, 14, 15, 24, 28, 29). 따라서 각 변이주들의 DNA 상해제인 MMS에 대한 감수성을 조사하기 위해 여러 농도의 MMS를 첨가한 YPD배지에서 조사하였다. 그 결과, 야생 주에서는 그 생존율에 영향을 주지않는 MMS의 농도에서도 cos36, cos37, cos42, cos52, 은 비교적 강한 감수성을 보였고, cos28, cos32, ci>s33, cos40, cos43.
- 2와 3에 나타내었다. 또한 변이주들의 유전학적 특성을 조사하기 위하여 먼저 변이주와 야생주 간의 이형접합체인 이배체를 제작하여 CPO 약제에 대한 감수성으로서 변이의우 . 열성을 조사하였다.
- 새로운 변이주를 분리하였다. 먼저 변이주들을 분리하기 위해, 야생형 균주인 W303A와 W303B에 임의 돌연변이화를 수행하였다. MNNCG를 돌연변이원으로 사용하여 야생주의 생존율을 조사하여 Fig.
- 변이가 우성 혹은 열성임을 확인하기 위하여 반수체인 변이주와 다른 교배형을 지닌 야생주를 접합하여 이형 접합체 (hetrozygote)를 만들었다(2). 이배체의 확인은 mater의 조사와 포자 형성능력으로 결정하였다.
- 본 연구를 통하여 세포주기의 연구에 있어 새로운 약제의 도입이 가능하게 되었으며, 분자유전학적 방법으로 세포주기 중 각 단계에서 결손을 나타내는 변이주들의 분리가 이루어졌다. 이러한 변이주들을 이용하여 이에 상보하는 유전자의 클론닝의 수행이 가능하며, 이들 유전자의 특성분석을 통하여 세포주기의 각 단계에 작용하는 유전자의 특성을 연구할 수 있으리라 기대된다.
- 분자유전학적 접근을 통해 얻어졌다(25). 세포주기를 정지시키는 DNA 상해제나 DNA 복제 저해제를 처리한 후, 세포주기가 지연되지 않고 계속 진행하는 변이주를 조사하여 이에 상응하는 checkpoint 유전자들을 클로닝하였다. 이러한 유전자들을 이용한 연구 결과에서 checkpoint 기능이 단순히 세포주기를 정지시키는 것만 아니라 DNA 회복과 전사조절 특히 DNA 회복에 관여하는 유전자의 발현유도에도 관여한다는 사실을 알게 되었다 (21, 33).
- 세포주기에서 G1 기와 S기에 주목하여 이에 관련된 유전자를 분리하기 위해 G1 동조화를 일으키는 CPO에 감수성을 나타내는 새로운 변이주를 분리하였다. 먼저 변이주들을 분리하기 위해, 야생형 균주인 W303A와 W303B에 임의 돌연변이화를 수행하였다.
- 02%의 농도로 첨가하여 만들었고, YPD+HU 배지는 HU 농도가 각각 0, 50, 100 mM이 함유되도록 첨가하였다. 야생 주 W303A와 각 변이주를 2 ml의 YPD 액체배지에 접종하여 25℃에서 진탕 배양하여 1X107 cells/ml 세포수로 배양한 후, 균주를 (5X106)X5°, 5— 5~\ 5~3 cells/mi로 단계적으로 희석하여 준비하고, 그것을 위의 농도로 준비된 YPD+MMS 배지와 YPD + HU 배지에 streaking 및 spotting하여 3~4일간 배양한 후 감수성을 비교 조사하였다.
- 야생주와 변이주를 YPD 액체배지에 1X106 cells/m/S- 희석하여 2SC에서 2 시간 배양한 후, 균주를 양분하여 한 쪽은 CPO 를 처리하고 다른 쪽은 CPO를 처리하지 않은 상태로 진탕 배양하였다. 이때 CPO를 처리한 시간을 0시간으로 하여 6시간 처리 후 집균한다.
- 15 trpl-1 leu2-3, 112 canl-100), W3O3B(Mma ade2~l ura3-l his3- 11, 15 trpl-1 leu2-3, 112 canlJOO), W3O3A/B(X W303B: MAlci/a, ade2-l/ade2-l, ura3-l/ura3-l, his3-l 1, 15/his3- II, 15, trpl-l/trpl-1, leu2-3, 112Aeu2-3, 112, canl-100/canb 100). 야생주인 W3O3B와 W3O3A에 MNNG를 처리하여 돌연변이 화(mutagenesis)하였다. 분리된 변이주들의들의 이배체 형성 여부를 확인하기 위한 Mater 로는 KR20A-l(Mata, lysl-l) 과, KR20A-2 (Mata, &//)를 사용하였다.
- 1 M sorbitol, 40% ethanol 에 고정 시킨 후, DAPI (4, , 6-diamidino-2-phenilindole)로 염색흐}.여 형광현미경하에서 비교 관찰하였다.
- HU에 대한 감수성을 조사하였고, 유전학적 실험에 이용하기 위해 이배체(diploid)를 제작하여 변이주의 우 . 열성 변이와 포자형성률을 조사하고, 사분체 분석을 이용하여 포자의 생존율을 조사하였다.
- 분리된 각 변이주의 우 . 열성을 조사하기 위하여 반수체 변이주와 반수체 야생주를 교배하여 이형 접합체를 만들었다(14, 16). 이렇게 형성된 각각의 이형접합자를 mater 조사 및 포자형성을 유도하여 이배체임을 확인하였다(Fig.
- 위에서 얻어진 각각의 이배체를 SPM 배지에 patch하여 25°C 에서 4~5일간 배양한 후, 광학현미경하에서 세포를 계수하여 포자 형성율을 조사하였다. 또한 이렇게 얻어진 포자형성 균주를 100 μl의 TE(10 mM Tris-Cl pH7.
- 위의 과정에서 형성된 포자를 사용해서 사분체 분석을 수행하여 각 이배체의 포자 형성율을 조사하였다. 그 결과, 각 이배체의 포자의 생존율은 야생형과 비슷한 수준을 나타내었으나 cps28과 cos45의 경우에 야생주에 비해 약간 떨어짐을 확인할 수 있었다(Fig.
- 이 배지에서의 야생주 W3O3A의 생존율을 조사하여 생존에 영향을 미치지 않는 최대 농도를 CPO 감수성 변이 주의 분리 농도로 결정하였다.
- 25). 이러한 가능성을 조사하기 위하여 각 변이주들을 야생주와 함께 여러 농도의 HU를 첨가한 YPD 배지에서 감수성을 조사하였다. 그 결과, cos37, *42.
- 이러한 표현형에 의해 CPO에 대해 강한 감수성을 보이고 MMS와 HU에 대해서도 감수성을 보이는 cos28, cos30, cos33, cos36, cos37, cos42, cos45, cos46, cos47, cos50의 10개의 변이주를 선택하여 치사에 이르는 최종 표현형을 조사하였다. 그 결과, 대부분의 변이주에서 다소 야생형과는 다른 핵의 형태들을 보여주었으나, cos47의 경우에는 Fig.
- 이배체의 확인은 mater의 조사와 포자 형성능력으로 결정하였다. 이렇게 만들어진 변이주와 야생주의 이형 이배체의 CPO 약제에 대한 감수성을 조사하여 야생 주와 유사한 감수성을 나타내면 그 변이를 열성으로 분류하고, 변이주와 유사한 표현형을 나타내면 그 변이를 우성으로 분류하였다.
- 이렇게 결정된 농도를 기준으로 다시 야생형 균주에 MNNCG를 처리하여 돌연변이화하여 YPD 배지에 약 200〜 300 콜로니가 나타나도록 도말하여 25°C에서 3 일간 배양하였다. 이렇게 형성된 콜로니 중에서 변이주의 선별(screening)을 위해 야생주의 생존율에는 영향을 미치지 않는 농도인 190 CPO 약제가 첨가된 배지에 replica하여 16°C, 25°C, 37°C에서 4일간 배양하였다. 그 결과 총 75, 000 콜로니 중에서 각각 교배형 별로 a-type 16개의 변이주와 a-type 15개의 변이주가 분리되어 Ciclopirox Olamine Sen skive의 첫 글자를 따서 cos mutant라고 명명하였다(Fig.
- 만들었다(2). 이배체의 확인은 mater의 조사와 포자 형성능력으로 결정하였다. 이렇게 만들어진 변이주와 야생주의 이형 이배체의 CPO 약제에 대한 감수성을 조사하여 야생 주와 유사한 감수성을 나타내면 그 변이를 열성으로 분류하고, 변이주와 유사한 표현형을 나타내면 그 변이를 우성으로 분류하였다.
- 확인하였다. 이에 따라 세포주기에서 G1 기와 S기에 관련된 유전자들의 기작을 연구하기 위하여 CPO 약제에 대하여 감수성을 나타내는 cos(ciclopirox olamine .sensitive, cos27~cos57) 변이주를 분리하였다. 분리된 각 변이주가 세포 주기의 어느 시점에서 결손을 보이는지를 알아보기 위해 MMS.
- 확인된 이배체들을 YPD+CPO 배지에 도말하여 37℃에 배양한 후 그 표현형을 조사하였다. 이때 이형 접합체인 이배체의 표현형이 야생주와 같은 성질을 나타내면 그 변이는 열성 변이가 되며, 변이주와 같은 성질을 나타내면 우성 변이로 구분할 수 있다(26).
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 줄아효모 Sacchammyces 의 반수체 균주로는 W303A와 W303B가 사용되었고. 이배체 균주로는 이 두 균주를 교배한 W303A/B가 사용되었으며, 각 균주의 유전형은 다음과 같다; W3O3A(Mata ade2-l ura3-l his J-11.
- 야생주인 W3O3B와 W3O3A에 MNNG를 처리하여 돌연변이 화(mutagenesis)하였다. 분리된 변이주들의들의 이배체 형성 여부를 확인하기 위한 Mater 로는 KR20A-l(Mata, lysl-l) 과, KR20A-2 (Mata, &//)를 사용하였다.
- 균주로는 W303A와 W303B가 사용되었고. 이배체 균주로는 이 두 균주를 교배한 W303A/B가 사용되었으며, 각 균주의 유전형은 다음과 같다; W3O3A(Mata ade2-l ura3-l his J-11. 15 trpl-1 leu2-3, 112 canl-100), W3O3B(Mma ade2~l ura3-l his3- 11, 15 trpl-1 leu2-3, 112 canlJOO), W3O3A/B(X W303B: MAlci/a, ade2-l/ade2-l, ura3-l/ura3-l, his3-l 1, 15/his3- II, 15, trpl-l/trpl-1, leu2-3, 112Aeu2-3, 112, canl-100/canb 100). 야생주인 W3O3B와 W3O3A에 MNNG를 처리하여 돌연변이 화(mutagenesis)하였다.
- ) 배지 역시 멸균한 배지를 식힌 후 여러 농도로 첨가하여 사용하였다. 이배체 세포의 포자 형성 조사에는 SPM(sporulation medium: 포자형성배지; 1% potassuim acetate, ().1% bacto-yeast extract, 0.05% glucose, 2% agar) 배지를 사용하였다(2).
- 이용하였다. 효모의 배양에는 영양배지로 YPD(2% polypeptone, 2% glucose. 1% yeast extract)를 사용하였다. 온도 감수성을 조사 조건으로 ts(thermosensitive)는 37°C, cs(cold sensitive)는 16>C에서 배양하였다.
이론/모형
- 출아효모의 배지 조성 및 배양 조건에는 Sherman 등의 방법 (27)을 이용하였다. 효모의 배양에는 영양배지로 YPD(2% polypeptone, 2% glucose.
성능/효과
- 2, 3 및 Table 1). 전체 31개의 변이주 중에서 cos27, cos42는 CPO에 대해서 강한 감수성을, cos30, cos31, cos32, cos37, cos45, cos46, cos47, cos48, cos56은 CPO에 대해서 약한 감수성을 보였고, cos35, cos41, cos49, cos50, cos51, cos53, cos57은 CPO배지 중 37"C에서 성장하지 않는 고온 감수성 및 CPO 감수성 변이주 (thermosensitive; ts-CPO sensitive mutant)로 나타났ML, 는 CPO 배지 중 16°C의 배양조건에서 성장하지 않는 약한 저온 감수성 및 CPO 감수성 변이주(coldsensitive; cs-CPO sensitive mutant)로 보여지며, cos28, cos29, cos33, cos34, cos36, cos38. cos40, cos43.
- 8). 그 결과 야생주는 59.3%의 포자 형성율을 보였고, 각 변이주들은 Table 2에서와 같이 야생주보다는 약간 낮은 포자 형성율을 보여 주었다. 늑히 의 경우에는 야생형 균주보다 20% 낮은 포자 형 성율을 보였다.
- 이렇게 형성된 콜로니 중에서 변이주의 선별(screening)을 위해 야생주의 생존율에는 영향을 미치지 않는 농도인 190 CPO 약제가 첨가된 배지에 replica하여 16°C, 25°C, 37°C에서 4일간 배양하였다. 그 결과 총 75, 000 콜로니 중에서 각각 교배형 별로 a-type 16개의 변이주와 a-type 15개의 변이주가 분리되어 Ciclopirox Olamine Sen skive의 첫 글자를 따서 cos mutant라고 명명하였다(Fig. 2, 3 및 Table 1). 전체 31개의 변이주 중에서 cos27, cos42는 CPO에 대해서 강한 감수성을, cos30, cos31, cos32, cos37, cos45, cos46, cos47, cos48, cos56은 CPO에 대해서 약한 감수성을 보였고, cos35, cos41, cos49, cos50, cos51, cos53, cos57은 CPO배지 중 37"C에서 성장하지 않는 고온 감수성 및 CPO 감수성 변이주 (thermosensitive; ts-CPO sensitive mutant)로 나타났ML, 는 CPO 배지 중 16°C의 배양조건에서 성장하지 않는 약한 저온 감수성 및 CPO 감수성 변이주(coldsensitive; cs-CPO sensitive mutant)로 보여지며, cos28, cos29, cos33, cos34, cos36, cos38.
- 열성을 조사하였다. 그 결과, cos42 변이주를 제외한 나머지 변이주는 모두 열성 변이로 확인되었고, cos42는 불완전 우성으로 나타났다.
- 위의 과정에서 형성된 포자를 사용해서 사분체 분석을 수행하여 각 이배체의 포자 형성율을 조사하였다. 그 결과, 각 이배체의 포자의 생존율은 야생형과 비슷한 수준을 나타내었으나 cps28과 cos45의 경우에 야생주에 비해 약간 떨어짐을 확인할 수 있었다(Fig. 9). 이러한 사분체 분석을 통해 얻어진 포자를 다시 교배형인 mater를 조사하여 각 변이주의 서로 다른 교배형인 a와 a type의 cos 변이주를 획득할 수 있었다.
- 선택하여 치사에 이르는 최종 표현형을 조사하였다. 그 결과, 대부분의 변이주에서 다소 야생형과는 다른 핵의 형태들을 보여주었으나, cos47의 경우에는 Fig. 8에서와 같이 한 세포안에두 개의 핵이 존재하는 형태를 나타내었고, 의 경우에는 핵이 절편화된 형태를 보여주었다. 이는 cos47변이주가 세포질 분열 없이 핵의 분열만 일어난 세포질 분열의 결손을 나타내는 것으로 보여지며, 의 경우에는 핵의 절편화를 나타내었다.
- 따라서 각 변이주들의 DNA 상해제인 MMS에 대한 감수성을 조사하기 위해 여러 농도의 MMS를 첨가한 YPD배지에서 조사하였다. 그 결과, 야생 주에서는 그 생존율에 영향을 주지않는 MMS의 농도에서도 cos36, cos37, cos42, cos52, 은 비교적 강한 감수성을 보였고, cos28, cos32, ci>s33, cos40, cos43. cos46, cos48, 은 MMS에 대해 약한 감수성을 보였다(Fig.
- 본 연구에서는 세포주기 중에서도 특히 G1 과 S기의 경계의 SIART의 조절 기작에 주목하여, 이 시기에 작용하는 유전자의 변이주를 동정하고 분석하는데 중점을 두었다. 변이주의 동정에 사용된 항곰팡이성 약제인 CPO는 포유동물 세포인 HeLa 세포에서 G1 동조화를 유도한다고 보고되었으며(32), 본 연구에서 출아효모에서도 G1 arrest 효과가 나타남을 알 수 있었다.
- 이때 이형 접합체인 이배체의 표현형이 야생주와 같은 성질을 나타내면 그 변이는 열성 변이가 되며, 변이주와 같은 성질을 나타내면 우성 변이로 구분할 수 있다(26). 본 연구에 이용된 전체 10개의 변이주 중에 cos28, cos30, cos33, cos36, cos39, cos45, cos46, cos47, cosSO은 모두 야생형과 같은 성질을 나타내어 열성 변이주로 확인되었고, cos42는 낮은 CPO 농도에서는 야생형의 성질을 나타내고 높은 CPO 농도에서는 변이주의 성질을 보이는 불완전 우성의 표현형을 나타내었다(Fig. 8).
- 9). 이러한 사분체 분석을 통해 얻어진 포자를 다시 교배형인 mater를 조사하여 각 변이주의 서로 다른 교배형인 a와 a type의 cos 변이주를 획득할 수 있었다.
- 세포주기를 정지시키는 DNA 상해제나 DNA 복제 저해제를 처리한 후, 세포주기가 지연되지 않고 계속 진행하는 변이주를 조사하여 이에 상응하는 checkpoint 유전자들을 클로닝하였다. 이러한 유전자들을 이용한 연구 결과에서 checkpoint 기능이 단순히 세포주기를 정지시키는 것만 아니라 DNA 회복과 전사조절 특히 DNA 회복에 관여하는 유전자의 발현유도에도 관여한다는 사실을 알게 되었다 (21, 33).
- 이를 배경으로 본 논문에서는 세포주기의 START 진행과 DNA 복제개시를 연결하는 시기인 G1/S기에 주목하여, 포유동물 세포인 HeLa cell에서 GI 동조화(synchronization)를 유도한다고 보고되어진(32) CPO (ciclopirox olamine) 약제를 출아효모에 처리하여 포유동물 세포와 같이 G1 arrest가 일어남을 확인하였다. 이에 따라 세포주기에서 G1 기와 S기에 관련된 유전자들의 기작을 연구하기 위하여 CPO 약제에 대하여 감수성을 나타내는 cos(ciclopirox olamine .
후속연구
- 이러한 변이주들을 이용하여 이에 상보하는 유전자의 클론닝의 수행이 가능하며, 이들 유전자의 특성분석을 통하여 세포주기의 각 단계에 작용하는 유전자의 특성을 연구할 수 있으리라 기대된다.
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