홍삼추출액의 신경성체줄기세포 성장과 생존에 미치는 영향을 분석하고자 human neuronal stem cell line인 F3 cell을 배양한 후 홍삼추출액을 여러 농도로 희석하여 MTT assay로 cell viability를 측정하였고 FACS analysis로 cell Cycle변화를 측정하였다. 특정한 농도에서는 세포가 증식되는 경향을 보였으며 농도가 증가되면서 viability가 감소되는 현상을 확인할 수 있었다. Cell cycle 분석상 세포증식시에는 5 phase 및 G2/M phase가 증가되는 경향을 보였고, viability가 감소되면서 S phase가 감소되고 G0/G1 phase 가 증가 되었다. 한편 DNA fragmentation이 cell viability감소에 따라 증가되었으나, Caspase 3 activation 또는 Bax expression과는 관련성이 적었다.
홍삼추출액의 신경성체줄기세포 성장과 생존에 미치는 영향을 분석하고자 human neuronal stem cell line인 F3 cell을 배양한 후 홍삼추출액을 여러 농도로 희석하여 MTT assay로 cell viability를 측정하였고 FACS analysis로 cell Cycle변화를 측정하였다. 특정한 농도에서는 세포가 증식되는 경향을 보였으며 농도가 증가되면서 viability가 감소되는 현상을 확인할 수 있었다. Cell cycle 분석상 세포증식시에는 5 phase 및 G2/M phase가 증가되는 경향을 보였고, viability가 감소되면서 S phase가 감소되고 G0/G1 phase 가 증가 되었다. 한편 DNA fragmentation이 cell viability감소에 따라 증가되었으나, Caspase 3 activation 또는 Bax expression과는 관련성이 적었다.
The present study is to determine whether the Red-ginseng extract has a proliferative or cytotoxic effect on the human neuronal stem cells(hNSCs). The hNSCs were grown and incubated with different doses of Red-ginseng extract. We tested the proliferative or cytotoxic effects by MTT and FACS analysis...
The present study is to determine whether the Red-ginseng extract has a proliferative or cytotoxic effect on the human neuronal stem cells(hNSCs). The hNSCs were grown and incubated with different doses of Red-ginseng extract. We tested the proliferative or cytotoxic effects by MTT and FACS analysis. Cell viability cell cycle analysis, DNA fragmentation, and bax or PARP expressions were evaluated. The hNSCs showed a proliferafe trend with its peak concentration at 0.3 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$. Beyond this point, higher doses decreased viabilities and showed a cytotoxic effect at 10 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$. There was a tendency of increased S and G2/M phases during cell proliferation. In a cytotoxic condition, decreased S phase and increased G0/G1 phases were noted, suggesting cell cycle arrest. The cytotoxic effect was associated with increase DNA fragmentation in a dose-dependent manner, However PARP cleavage or bax expression was not detected. Our results suggest that Red-ginseng extract has dual effects, the cell proliferative or cytotoxic effect, on hNSCs in vitro with dose-dependent manner.
The present study is to determine whether the Red-ginseng extract has a proliferative or cytotoxic effect on the human neuronal stem cells(hNSCs). The hNSCs were grown and incubated with different doses of Red-ginseng extract. We tested the proliferative or cytotoxic effects by MTT and FACS analysis. Cell viability cell cycle analysis, DNA fragmentation, and bax or PARP expressions were evaluated. The hNSCs showed a proliferafe trend with its peak concentration at 0.3 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$. Beyond this point, higher doses decreased viabilities and showed a cytotoxic effect at 10 $\mu\textrm{g}$/$m\ell$. There was a tendency of increased S and G2/M phases during cell proliferation. In a cytotoxic condition, decreased S phase and increased G0/G1 phases were noted, suggesting cell cycle arrest. The cytotoxic effect was associated with increase DNA fragmentation in a dose-dependent manner, However PARP cleavage or bax expression was not detected. Our results suggest that Red-ginseng extract has dual effects, the cell proliferative or cytotoxic effect, on hNSCs in vitro with dose-dependent manner.
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문제 정의
홍삼추출액의 섭취가 생체내의 성체줄기세포에 어떠한 영향을 주는지는 아직 알려진 바가 없으며, 줄기세포에 의한 신경계 기능회복 및 작용기전역시 아직 알려진 바가 없다. 본 연구는 홍삼추출액이 F3라는 인간성체신경줄기세포의 실험관 내의 viability에 미치는 효과를 관찰한 것이며 cell proliferation 및 세포독성의 추가기전과 향후 in vivo study 를 통해 재검증이 필요한 부분으로 사료된다.
따라서 인삼의 신경계 기능회복의 기전의 하나로 신경줄기세포에 대한 영향을 추측할 수 있으나, 알려진 바는 없다. 본 연구에서는 홍삼추출액이 신경줄기세포에 미치는 영향을 확인하기 위하여, cell culture model에서 인간 신경성 체줄기세포의 증식 또는 세포독성여부를 관찰하였고, 관련된 세포주기 변화를 분석하였다.
본 연구에서는 흥삼추출액이 신경줄기세포에 미치는 영향을 일차적으로 cell viability에 중점을 두어 분석하고, prolif eration 및 cytotoxicity를 보이는 경우 cell cycle의 변화와 DNA fragmentation, Bax, PARP등 apoptotic cell death과 관련된 현상을 관찰하고자 하였다. 홍삼추출액이 첨가하였을 경우 일정한 농도까지는 세포가 증식되는 경향을 보이나 농도가 증가될수록 cell viability를 감소시키는 현상이 관찰되었다.
가설 설정
Bax and PARP expression. A. The expression of bax protein(23 kd) reduced to the 50% of control level when the cells are in proliferation. However, at cytotoxic concentration, the protein levels were unchanged by densitometric measure.
Y-axis denotes the ratio of signal to the control. B. The PARP expression is unchanged at a concentration of 0.3 μg/ml. At 10 |ig/ml, The full- length protein level(116 kd) was decreased but the cleavage products(89 kd & 24 kd) were not increased.
제안 방법
5mg4nl amphotericin B(Gibco- BRL, USA)에서 일차 배양 하였다. 7-14일 후 v-myc 을 포함한 amphotropic retroviral vectoij 이용하여 세포를 불멸화하 였으며, 여러 클론중 하나에 xenotropic retroviral vectoi# 이용하여 lac~Z 유전자를 주입하였다. High-glucose DMEM con taining insulin(10 g/ml), transferrin(10 sodium selen ite (30 nM), hydrocortisone(50 nM), triiodothyronine(0.
TBST로 15분, 5분, 5분간 wash후 peroxidase-labeled secondary antibody(anti-mouse 또는 anti-rabbit; Pierce제)를 1:10000으로 희석하여 5% non-fat dry milk in TBST에 상온에서 1시간동안 Mcubation하였고 다시 TBST에 5회 wash 후 ECL(Amersham)로 develop 하였다. Band는 image ana- lyzei로 density 를 정량화 하였다.
Cell cycle과 nuclear DNA fragmentation을 분석하기 위하여 FACS analysis를 시행하였다. F3 cells을 60 mm dishes에 100만개를 분주하고 24시간 후에 여러 농도의 홍삼 추출액을 24시간 처리하였다. 0.
7-14일 후 v-myc 을 포함한 amphotropic retroviral vectoij 이용하여 세포를 불멸화하 였으며, 여러 클론중 하나에 xenotropic retroviral vectoi# 이용하여 lac~Z 유전자를 주입하였다. High-glucose DMEM con taining insulin(10 g/ml), transferrin(10 sodium selen ite (30 nM), hydrocortisone(50 nM), triiodothyronine(0.3 nMM 포함한 serum-free medium(DM4)에서 배앙하였다.16-17) 생성된 세포주를 HB1.
01% EDTA로 세포를 취합한 후 ice-cold 70% ethanol로 fix하였다. S phase, G0-G1, G2-M phase의 proportion을 측정하였고, DNA fragmentation을 확인하기 위해 DNA-binding fluoro- chrone propidium iodide(50로 염색을 하고 flow cytometry로 비율을 분석하였다.
1% Tween20)에 1시간동안 상온에서 blocking후 primary antibody(anti-bax, anti-PARP)를 5% non-fat dry milk TBST에 dilution하여 4도에서 overnight incubation하였 다. TBST로 15분, 5분, 5분간 wash후 peroxidase-labeled secondary antibody(anti-mouse 또는 anti-rabbit; Pierce제)를 1:10000으로 희석하여 5% non-fat dry milk in TBST에 상온에서 1시간동안 Mcubation하였고 다시 TBST에 5회 wash 후 ECL(Amersham)로 develop 하였다. Band는 image ana- lyzei로 density 를 정량화 하였다.
홍삼추출액이 첨가하였을 경우 일정한 농도까지는 세포가 증식되는 경향을 보이나 농도가 증가될수록 cell viability를 감소시키는 현상이 관찰되었다. 즉 홍삼추출액의 농도에 따른 성체신경줄기세포의 증식 및 세포독성효과의 두가지의 서로 다른 효과를 관찰하였다.
경우에 따라 DNAse를 100μg을 첨가하였다. 진탕을 한 후 ice에서 5분간 incubation하고 Brafod 또는 BSA방법을 이용하여 protein의 농도를 측정하고 100 mM DTT> 첨가하여 5분간 boiling한 후 한 well당 20ug씩 loading하였다. Sepa rating gel은 10% Acrylamide, 0.
Neuronal stem cell line인 F3 cell을 충분한 수가 될 때까지 계대배양한 후 96well plate에 plating하였다. 홍삼추출액을 culture media에 여러 농도로 희석해서 사용하였으며, 농도에 따른 세포의 증식 및 세포독성여부를 확인하였다. 사용된 흥삼추출액은 고려인삼주식회사에서 판매되고 있는 상품으로(태극홍삼정; 상품코드 1072091056) 대한민국(한국산) 6년근 홍삼을 주원료로 제조되었고 홍삼 농축액의 주요 성분은 홍삼성분 70m^g, 미삼류 100%이다.
홍삼추출액의 신경성체줄기세포 성장과 생존에 미치는 영향을 분석하고자 human neuronal stem cell line인 F3 c이 1을 배양한 후 홍삼추출액을 여러 농도로 희석하여 MTT assay로 cell viability를 측정하였고 FACS analysis로 cell cycle변화를 측정하였다. 특정한 농도에서는 세포가 증식되는 경향을 보였으며 농도가 증가되면서 viability가 감소되는 현상을 확인할 수 있었다.
대상 데이터
신경줄기세포는 태아의 뇌에서 적출한 F3 ceU line(Gift from Pf. SU Kim(Univ of British Columbia)을 이용하였고 인간 줄기세포 사용에 대한 내용은 서울대학병원 IRB 위원회의 심의를 통과하였다. 이 실험에 사용된 인간줄기세포는 15주된 배아의 종뇌에서 분리배양된 것으로 배아 종뇌에 reporter^ lac-Z와 불명화를 위해 v-myc gene 을 삽입하였다.
홍삼추출액을 culture media에 여러 농도로 희석해서 사용하였으며, 농도에 따른 세포의 증식 및 세포독성여부를 확인하였다. 사용된 흥삼추출액은 고려인삼주식회사에서 판매되고 있는 상품으로(태극홍삼정; 상품코드 1072091056) 대한민국(한국산) 6년근 홍삼을 주원료로 제조되었고 홍삼 농축액의 주요 성분은 홍삼성분 70m^g, 미삼류 100%이다. Cell viability는 MTT 용액을 200μl/we11씩 넣고 3시간 배양 후 DMSO 200μl/well을 넣고 30분간 섞어준 후 520nm에서 흡광도를 측정하였다.
SU Kim(Univ of British Columbia)을 이용하였고 인간 줄기세포 사용에 대한 내용은 서울대학병원 IRB 위원회의 심의를 통과하였다. 이 실험에 사용된 인간줄기세포는 15주된 배아의 종뇌에서 분리배양된 것으로 배아 종뇌에 reporter^ lac-Z와 불명화를 위해 v-myc gene 을 삽입하였다. 배아 종뇌를 Dulbecco's modified Eagle mediumQDMEM) with high glu cose supplemented with 5% horse serum, 20mg/ml gen- tamicin(Gibco-BRL} USA), 2.
불멸화된 세포의 subculture는 Dulbecco's modified Eagle medium(DMEM)에 10%(v/v) Fetal Bovine Serum(FBS, Giboco), l%(v/v) penicillin-streptomycin(5000 units penicil lin; 5000 units streptomycin, Sigma)에서 배양하였고. 저장에는 20~50% FBS, 10%(v/v) dimethyl sulfoxide(DMSO, Fisher Scientific)# 사용하였다.
이론/모형
Cell cycle과 nuclear DNA fragmentation을 분석하기 위하여 FACS analysis를 시행하였다. F3 cells을 60 mm dishes에 100만개를 분주하고 24시간 후에 여러 농도의 홍삼 추출액을 24시간 처리하였다.
성능/효과
DNA-binding fluorochrone propidium iodide로 FACS analysis상 control에 비해 cell viability의 감소를 보이는 6.25|ig/ml과 50μg/ml의 농도를 비교하였을 경우 DNA fragmentation0] cell viability감소에 따라 증가되는 소견을 관찰할 수 있었다(Fig. 4).
S phase, G2/M phase, G0/G1 phase를 각각 prolifera tive condition(0.3μg/ml)과 cytotoxic condition(10μg/ml) 에 서 분석한 결과, proliferative conditior에서는 통계적인 유의성은 없었으나 control에 비해 S 및 G2/M phase가 증가되는 경향을 보였고, G0/G1 phase의 감소를 관찰하였다. 반면 cytotoxic condition하에서는 반대로 S 및 G2/M phase의 감소, G0/G1 phase의 증가를 보였다 (Fig.
287로 의미 있는 차이를 보이지 않았다. 농도에서 6시간, 16시간, 20시간 배양을 한 결과 각각 absorbance의 평균이 0.273, 0.263, 0.282으로 배양시간이 길어지면서 viability가 증가되는 경향을 관찰하였다.
본 연구에서 cell cycle phase을 비교해본 결과 S phase의 증가경향으로 DNA의 합성이 증가되었으리라 추측할 수 있다. 그러나 0.
홍삼추출액의 신경성체줄기세포 성장과 생존에 미치는 영향을 분석하고자 human neuronal stem cell line인 F3 c이 1을 배양한 후 홍삼추출액을 여러 농도로 희석하여 MTT assay로 cell viability를 측정하였고 FACS analysis로 cell cycle변화를 측정하였다. 특정한 농도에서는 세포가 증식되는 경향을 보였으며 농도가 증가되면서 viability가 감소되는 현상을 확인할 수 있었다. Cell cycle분석상 세포증식시에는 S phase 및 G2/M phase가 중가되는 경향을 보였고, viability가 감소되면서 S phase가 감소되고 G0/G1 phase 가 증가되었다.
후속연구
그러나 PARP cleavage fragment^ 증가가 없었던 점으로 보아 Caspase 3의 activation과는 다른 pathway를 통해 세포사가 진행됨을 고려해볼 수 있고, Bax protein 변화와는 무관한 세포사로 사료된다. PARP의 full-length pro- tein의 감소로 인한 소견은 RVRP activation에 의한 세포사 를 촉진하는 현상의20-22)보상작용으로 추측할 수 있으나 향후 추가 연구가 필요한 부분이다.
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