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문제 정의
- MG에 의한 독성은 노출 시간, 온도 및 농도에 의해서 증가하며 발암, 돌연변이, 염색체 변형, 호흡기 장애 등을 유발하는 것으로 알려져 있는데, MG에 노출시킨 어류의 혈액에서 생화학적인 변형 (Srivadysvr et al, 2004) 및 생식력 감소, 발암 및 돌연변이 등 (Meyer and Jorgense, 1983)이 보고되 었다. 본 연구에서는 양식 과정에서 사용된 MG가 환원되어서 존재하는 LMG를 효과적으로 추출.정량하기 위하여 LE, LLE 및 SPE 방법을 어종별로 살펴보았다.
- 비교 분석함으로서 신속.정확한 MG 및 LMG 분석 방법을 검토하고자 하였다.
제안 방법
- 0.1% ascorbic acid을 첨가한 methanol을 사용하여 100 mg/L 의 농도로 각각 조제한 MG 및 LMG 표준용액을 혼합하여 0.1, 0.2, 0.5 mg/L의 혼합 용액을 만든 후, 갈색 vial에 담고 4 °C 에 보관하면서 MG 및 LMG의 안정성를 살펴보았다.
- Bergwerff and Scherpenisse (2003)의 방법 을 변 형 하여 시 료 2 g에 Mcllvain solution (pH 3.0) 1.5 mL, 1-hexanesulfonic acid (IM) 100hL, TMPD (0.1%) 50 〃L, acetonitrile 9 mL을 첨가하여 10분 동안 교반한 다음, 3, 400xg에서 5분간 원심분리를 하여 상증액은 새로운 polyethylene tube에 담았다. 잔여물에 Mcllvain solution (pH 6.
- 9에서 50%가 이온화된다 (Goldacre and Philips, 1949). MG 및 LMG는 각각 620 nm, 265 nm에서 최대흡수파장을 가지며 두 물질을 동시에 분석하기 위하여 산화납 반응기를 사용하여 LMG을 MG로 산화시 켜 분석을 한다. Bergwerft and Scherpenisse (2003)는 송어, 연어 등에 대하여 LMG을 산화시켜서 HPLC로 분석하였고 Scherpenisse and Bergwerff (2005)는 메기, 송어, 틸라피아, 무지개 송어에서 MS detector^ 사용하여 MG 및 LMG 분석을 하였다.
- MG 및 LMG를 무지개 송어에 50, 500“g/kg 농도로 spiking흐卜 여 보관온도 (-20°C, 4°C)에 따른 안정성을 살펴보았다. MG를 -20 °C 에서 보관하면 6개월 안에 20%의 감소를 보였으며 50 建/kg보다는 500“g/kg가 더 안정하였으며 LMG는 -20 °C 에서 6개월 동안 큰 변화가 없었지만 4°C에서 보관한 MG 및 LMG 는 4일 안에 60%의 감소를 보인다고 하였다.
- SPE cartridge (60 mg, 3 mL)는 Waters Corporation (Milford, MA, USA)사의 Oasis MCX모델을 구입하여 사용하였다. N, N, N', N-tetramethyl-1, 4-phenylenediamine dihydro chloride (TMPD) 및 3, 3', 5§-tetramethylbenzidine (TMB)이 1 mg/mL가 되도록 methanol로 제조하였고 Mcllvain solution (pH 3.0)은 0.2M N&HPO4 18.9 mL과 0.1 M citric acid 81.1 mL을 혼합하여 제조하였으며 Mcllvain solution (pH 6.0)은 0.2 M Na2HPO4 62.5 mL과 0.1 M citric acid 37.5 mL을 혼합하여 제조하였다. 실험에 사용된 모든 유기용매는 Burdick & Jackson (Muskegon, MI)사의 HPLC 등급을 사용하였으며 그 이외에 사용한 시약은 특급 또는 HPLC 등급을 사용하였다.
- 이 추출액을 회전증발 농축기로 농축하고 methanol 2 al丄로 녹여, 0.2 以m syringe filter로 여 과한 후 HPLC 의 분석에 사용하였다.
- Louis, MO, USA)로부터 구입하였으며 각각의 표준용액 표준물질을 HPLC급 methanol에 녹여 100mg/L의 농도로 조제하여 -20°C에 보관하면서 사용하였다. 검량선 작성은 각각의 MG 및 LMG 표준용액을 혼합하여 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.0mg/L의 농도로 제조하여 사용하였다. SPE cartridge (60 mg, 3 mL)는 Waters Corporation (Milford, MA, USA)사의 Oasis MCX모델을 구입하여 사용하였다.
- 따라서 본 연구에서는 MG와 LMG의 저장조건에 따른 시간별 안정성을 살펴보았으며 어종에 따른 liquid extraction (LE), liquid-liquid extraction (LLE) 및 solid phase extraction (SPE) 방법으로 MG 및 LMG를 추출하여 HPLC를 이용하여 회수율을 비교 분석함으로서 신속.정확한 MG 및 LMG 분석 방법을 검토하고자 하였다.
- 5% hydroxylamine HC1 2 mL, acetonitrile 8 mL을 첨가하여 10분 동안 교반한 다음, 3, 400xg 에서 5분간 원심분리를 하였다. 원심분리를 실시한 액을 0.2 以m syringe filtei로 여과한 후 HPLC의 분석에 사용하였다. Liq냐id-li이uid extraction (LLE)
- 본 연구에서는 양식 과정에서 사용된 MG가 환원되어서 존재하는 LMG를 효과적으로 추출.정량하기 위하여 LE, LLE 및 SPE 방법을 어종별로 살펴보았다. LE는 간단하면서 빠른 시간에 전 처리가 가능하지만 회수율이 낮게 나타났으며 LLE는 MG 및 LMG의회수율이 좋게 나타났지만 어종에 따른 회수율 차이가 나타났다.
대상 데이터
- HPLC 장비는 quat pumps (G1311A), degasser (G1379A), auto sampler (G1329A), column oven (G1316A), UV detector (G1315B)가 장착되 어 있는 Agilent 1100 series (Palo Alto, CA, USA)를 사용하였다. Column ove온도는 35 °C로 유지시켰으며 검줄파장은 620 nm이 었다.
- Malachite green oxalate salt (FW: 929.00) 및 leucomalachite green (FW: 330.48)은 Sigma Chemicals (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였으며 각각의 표준용액 표준물질을 HPLC급 methanol에 녹여 100mg/L의 농도로 조제하여 -20°C에 보관하면서 사용하였다. 검량선 작성은 각각의 MG 및 LMG 표준용액을 혼합하여 0.
- 0mg/L의 농도로 제조하여 사용하였다. SPE cartridge (60 mg, 3 mL)는 Waters Corporation (Milford, MA, USA)사의 Oasis MCX모델을 구입하여 사용하였다. N, N, N', N-tetramethyl-1, 4-phenylenediamine dihydro chloride (TMPD) 및 3, 3', 5§-tetramethylbenzidine (TMB)이 1 mg/mL가 되도록 methanol로 제조하였고 Mcllvain solution (pH 3.
- 본 실험에 사용된 시료는 양식으로 생산되어 수입되는 새우, 가물치, 틸라피아, 연어, 송어, 방어를 구입하여 근육 부위만 취하여 homogenizer (HMF-985, Hanil, Korea)로 균질화 하였다. 조제된 시료는 polyethylene tube에 넣어 -20C 에서 보관하였고 실험 당일에 상온에서 녹인 후, MG 및 LMG 혼합용액 (10 mg/L)을 시료에 100〃L으로 spiking하여 회수율 즉정용시료로 사용하였다.
- 5 mL을 혼합하여 제조하였다. 실험에 사용된 모든 유기용매는 Burdick & Jackson (Muskegon, MI)사의 HPLC 등급을 사용하였으며 그 이외에 사용한 시약은 특급 또는 HPLC 등급을 사용하였다.
- X150 mm, 5 〃m)를 사용하였으며 산화납 반응 기는 주문 제작한 PbO2 column을 분석 column 뒤에 연결하여 분석하였다. 이동상은 0.1% hexanesulfonic acid를 함유하는 0.05 M citric acid 및 0.05 M sodium acetate의 혼합용액 (A)과 acetonitrile (B)을 사용하였다. 이동상 기울기는 A:B가 초기에 60:40에서 18분간 유지 후 15분 동안에 25:75으로 유지시켰으며 컬럼의 재평형을 위해 日를 40%로 7분간 흘려주었다.
데이터처리
- 어종에 따른 MG 및 LMG의 회수율결과 통계처리는 SPSS 통계 프로그램을 이용하여 측정치에 대한 평균 및 표준편차를 구하였으며 차이검정은 Duncan의 다중비교로 p<0.05에서 결과 간의 유의성을 검정하였다.
성능/효과
- 3은 추출방법에 따른 어종별 회수율을 살펴보았다. LE, LLE에서 가물치, 새우의 MG 및 LMG 회수율이 다른 어종보다 높게 나타났으며 방어, 송어는 낮게 나타났다. 이러한 차이는 어종이 가지고 있는 고유의 matrix 특성 및 추출 방법에 따른 차이로 사료된다.
- 정량하기 위하여 LE, LLE 및 SPE 방법을 어종별로 살펴보았다. LE는 간단하면서 빠른 시간에 전 처리가 가능하지만 회수율이 낮게 나타났으며 LLE는 MG 및 LMG의회수율이 좋게 나타났지만 어종에 따른 회수율 차이가 나타났다. SPE에서는 MG의 회수율이 30% 미만이지만 LMG는 80% 이상으로 나타났다.
- 68% (가물치)로 나타났다. LLE의경우 대체로, LE보다 회수율이 높게 나타났으며 MG 및 LMG 의 회수율이 양호하였다. Choi et al.
- MG 및 LMG의 혼합 용액을 각각 0.1, 0.2, 0.5, 1.0 그리고 2.0mg/L의 농도로 희석하여 HPLC로 분석한 다음 농도 대에 따른 peak 면적비를 이용하여 표준곡선을 작성한 결과 MG의 R2값은 0.9993, LMG은 0.9997로 매우 양호한 직선성을 나타내었다 (Fig. 1).
- 것 이 다. MG는 49.87 (송어 )에 서 72.53%(새 우), LMG는 41.71(방어)에서 71.60% (가물치)로 나타났는데, 대체로 LMG 보다 MG의 회수율이 높게 나타났다. 또한 어종별 회수율을 살펴보면, 지질 함량이 낮은 어종일수록 회수율이 높게 나타났다.
- MG를 -20 °C 에서 보관하면 6개월 안에 20%의 감소를 보였으며 50 建/kg보다는 500“g/kg가 더 안정하였으며 LMG는 -20 °C 에서 6개월 동안 큰 변화가 없었지만 4°C에서 보관한 MG 및 LMG 는 4일 안에 60%의 감소를 보인다고 하였다. 따라서 빛에 의해 쉽게 산화되는 MG의 경우, ascorbic acid를 첨가하면 안정성을 높일 수 있을 것으로 생각된다.
- 60% (가물치)로 나타났는데, 대체로 LMG 보다 MG의 회수율이 높게 나타났다. 또한 어종별 회수율을 살펴보면, 지질 함량이 낮은 어종일수록 회수율이 높게 나타났다. Sanders et al.
- (2005)은 SCX SPE을 이용하여 visible/fluorescence detec- tion으로 잉어의 MG 및 LMG 회수율을 살펴본 결과, MG는 62%, LMG는 90%로 보고하였다. 본 연구에서, SPE를 사용한 MG의 회수율은 낮게 나타났지만 LMG의 회수율은 높게 나타났다. MG는 수산 동물의 조직 내에서 LMG 형태로 존재하기 때문에 LMG를 MG의 불법 사용의 표지물질로 이용하고 있다.
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