Malachite green (MG), a triphenylmethane dye, is carcinogenic, mutagenic, teratogenic, a respiratory toxin, and causes chromosomal fractures. It is not permitted for use as an aquaculture veterinary drug in a number of countries. Sensitive extraction methods for MG and leucomalachite green (LMG), wh...
Malachite green (MG), a triphenylmethane dye, is carcinogenic, mutagenic, teratogenic, a respiratory toxin, and causes chromosomal fractures. It is not permitted for use as an aquaculture veterinary drug in a number of countries. Sensitive extraction methods for MG and leucomalachite green (LMG), which have long residence times in fish tissues, were developed. For LMG, the average recovery of liquid extraction (LE) ranged from 41.71 (yellowtail) to 71.60% (snakehead); the recovery of liquid-liquid extraction (LLE) was between 67.68 (yellowtail) and 83.68% (snakehead); and the average recovery of solid-phase extraction (SPE) ranged from 84.16 (yellowtail) to 92.92% (shrimp). The recovery of MG was less than 30% with SPE. However, the dye is found primarily as the colorless reduced leuco form in fish tissues.
Malachite green (MG), a triphenylmethane dye, is carcinogenic, mutagenic, teratogenic, a respiratory toxin, and causes chromosomal fractures. It is not permitted for use as an aquaculture veterinary drug in a number of countries. Sensitive extraction methods for MG and leucomalachite green (LMG), which have long residence times in fish tissues, were developed. For LMG, the average recovery of liquid extraction (LE) ranged from 41.71 (yellowtail) to 71.60% (snakehead); the recovery of liquid-liquid extraction (LLE) was between 67.68 (yellowtail) and 83.68% (snakehead); and the average recovery of solid-phase extraction (SPE) ranged from 84.16 (yellowtail) to 92.92% (shrimp). The recovery of MG was less than 30% with SPE. However, the dye is found primarily as the colorless reduced leuco form in fish tissues.
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문제 정의
MG에 의한 독성은 노출 시간, 온도 및 농도에 의해서 증가하며 발암, 돌연변이, 염색체 변형, 호흡기 장애 등을 유발하는 것으로 알려져 있는데, MG에 노출시킨 어류의 혈액에서 생화학적인 변형 (Srivadysvr et al, 2004) 및 생식력 감소, 발암 및 돌연변이 등 (Meyer and Jorgense, 1983)이 보고되 었다. 본 연구에서는 양식 과정에서 사용된 MG가 환원되어서 존재하는 LMG를 효과적으로 추출.정량하기 위하여 LE, LLE 및 SPE 방법을 어종별로 살펴보았다.
비교 분석함으로서 신속.정확한 MG 및 LMG 분석 방법을 검토하고자 하였다.
제안 방법
0.1% ascorbic acid을 첨가한 methanol을 사용하여 100 mg/L 의 농도로 각각 조제한 MG 및 LMG 표준용액을 혼합하여 0.1, 0.2, 0.5 mg/L의 혼합 용액을 만든 후, 갈색 vial에 담고 4 °C 에 보관하면서 MG 및 LMG의 안정성를 살펴보았다.
Bergwerff and Scherpenisse (2003)의 방법 을 변 형 하여 시 료 2 g에 Mcllvain solution (pH 3.0) 1.5 mL, 1-hexanesulfonic acid (IM) 100hL, TMPD (0.1%) 50 〃L, acetonitrile 9 mL을 첨가하여 10분 동안 교반한 다음, 3, 400xg에서 5분간 원심분리를 하여 상증액은 새로운 polyethylene tube에 담았다. 잔여물에 Mcllvain solution (pH 6.
9에서 50%가 이온화된다 (Goldacre and Philips, 1949). MG 및 LMG는 각각 620 nm, 265 nm에서 최대흡수파장을 가지며 두 물질을 동시에 분석하기 위하여 산화납 반응기를 사용하여 LMG을 MG로 산화시 켜 분석을 한다. Bergwerft and Scherpenisse (2003)는 송어, 연어 등에 대하여 LMG을 산화시켜서 HPLC로 분석하였고 Scherpenisse and Bergwerff (2005)는 메기, 송어, 틸라피아, 무지개 송어에서 MS detector^ 사용하여 MG 및 LMG 분석을 하였다.
MG 및 LMG를 무지개 송어에 50, 500“g/kg 농도로 spiking흐卜 여 보관온도 (-20°C, 4°C)에 따른 안정성을 살펴보았다. MG를 -20 °C 에서 보관하면 6개월 안에 20%의 감소를 보였으며 50 建/kg보다는 500“g/kg가 더 안정하였으며 LMG는 -20 °C 에서 6개월 동안 큰 변화가 없었지만 4°C에서 보관한 MG 및 LMG 는 4일 안에 60%의 감소를 보인다고 하였다.
SPE cartridge (60 mg, 3 mL)는 Waters Corporation (Milford, MA, USA)사의 Oasis MCX모델을 구입하여 사용하였다. N, N, N', N-tetramethyl-1, 4-phenylenediamine dihydro chloride (TMPD) 및 3, 3', 5§-tetramethylbenzidine (TMB)이 1 mg/mL가 되도록 methanol로 제조하였고 Mcllvain solution (pH 3.0)은 0.2M N&HPO4 18.9 mL과 0.1 M citric acid 81.1 mL을 혼합하여 제조하였으며 Mcllvain solution (pH 6.0)은 0.2 M Na2HPO4 62.5 mL과 0.1 M citric acid 37.5 mL을 혼합하여 제조하였다. 실험에 사용된 모든 유기용매는 Burdick & Jackson (Muskegon, MI)사의 HPLC 등급을 사용하였으며 그 이외에 사용한 시약은 특급 또는 HPLC 등급을 사용하였다.
이 추출액을 회전증발 농축기로 농축하고 methanol 2 al丄로 녹여, 0.2 以m syringe filter로 여 과한 후 HPLC 의 분석에 사용하였다.
Louis, MO, USA)로부터 구입하였으며 각각의 표준용액 표준물질을 HPLC급 methanol에 녹여 100mg/L의 농도로 조제하여 -20°C에 보관하면서 사용하였다. 검량선 작성은 각각의 MG 및 LMG 표준용액을 혼합하여 0.1, 0.2, 0.5, 1.0, 2.0mg/L의 농도로 제조하여 사용하였다. SPE cartridge (60 mg, 3 mL)는 Waters Corporation (Milford, MA, USA)사의 Oasis MCX모델을 구입하여 사용하였다.
따라서 본 연구에서는 MG와 LMG의 저장조건에 따른 시간별 안정성을 살펴보았으며 어종에 따른 liquid extraction (LE), liquid-liquid extraction (LLE) 및 solid phase extraction (SPE) 방법으로 MG 및 LMG를 추출하여 HPLC를 이용하여 회수율을 비교 분석함으로서 신속.정확한 MG 및 LMG 분석 방법을 검토하고자 하였다.
5% hydroxylamine HC1 2 mL, acetonitrile 8 mL을 첨가하여 10분 동안 교반한 다음, 3, 400xg 에서 5분간 원심분리를 하였다. 원심분리를 실시한 액을 0.2 以m syringe filtei로 여과한 후 HPLC의 분석에 사용하였다. Liq냐id-li이uid extraction (LLE)
본 연구에서는 양식 과정에서 사용된 MG가 환원되어서 존재하는 LMG를 효과적으로 추출.정량하기 위하여 LE, LLE 및 SPE 방법을 어종별로 살펴보았다. LE는 간단하면서 빠른 시간에 전 처리가 가능하지만 회수율이 낮게 나타났으며 LLE는 MG 및 LMG의회수율이 좋게 나타났지만 어종에 따른 회수율 차이가 나타났다.
대상 데이터
HPLC 장비는 quat pumps (G1311A), degasser (G1379A), auto sampler (G1329A), column oven (G1316A), UV detector (G1315B)가 장착되 어 있는 Agilent 1100 series (Palo Alto, CA, USA)를 사용하였다. Column ove온도는 35 °C로 유지시켰으며 검줄파장은 620 nm이 었다.
Malachite green oxalate salt (FW: 929.00) 및 leucomalachite green (FW: 330.48)은 Sigma Chemicals (St. Louis, MO, USA)로부터 구입하였으며 각각의 표준용액 표준물질을 HPLC급 methanol에 녹여 100mg/L의 농도로 조제하여 -20°C에 보관하면서 사용하였다. 검량선 작성은 각각의 MG 및 LMG 표준용액을 혼합하여 0.
0mg/L의 농도로 제조하여 사용하였다. SPE cartridge (60 mg, 3 mL)는 Waters Corporation (Milford, MA, USA)사의 Oasis MCX모델을 구입하여 사용하였다. N, N, N', N-tetramethyl-1, 4-phenylenediamine dihydro chloride (TMPD) 및 3, 3', 5§-tetramethylbenzidine (TMB)이 1 mg/mL가 되도록 methanol로 제조하였고 Mcllvain solution (pH 3.
본 실험에 사용된 시료는 양식으로 생산되어 수입되는 새우, 가물치, 틸라피아, 연어, 송어, 방어를 구입하여 근육 부위만 취하여 homogenizer (HMF-985, Hanil, Korea)로 균질화 하였다. 조제된 시료는 polyethylene tube에 넣어 -20C 에서 보관하였고 실험 당일에 상온에서 녹인 후, MG 및 LMG 혼합용액 (10 mg/L)을 시료에 100〃L으로 spiking하여 회수율 즉정용시료로 사용하였다.
5 mL을 혼합하여 제조하였다. 실험에 사용된 모든 유기용매는 Burdick & Jackson (Muskegon, MI)사의 HPLC 등급을 사용하였으며 그 이외에 사용한 시약은 특급 또는 HPLC 등급을 사용하였다.
X150 mm, 5 〃m)를 사용하였으며 산화납 반응 기는 주문 제작한 PbO2 column을 분석 column 뒤에 연결하여 분석하였다. 이동상은 0.1% hexanesulfonic acid를 함유하는 0.05 M citric acid 및 0.05 M sodium acetate의 혼합용액 (A)과 acetonitrile (B)을 사용하였다. 이동상 기울기는 A:B가 초기에 60:40에서 18분간 유지 후 15분 동안에 25:75으로 유지시켰으며 컬럼의 재평형을 위해 日를 40%로 7분간 흘려주었다.
데이터처리
어종에 따른 MG 및 LMG의 회수율결과 통계처리는 SPSS 통계 프로그램을 이용하여 측정치에 대한 평균 및 표준편차를 구하였으며 차이검정은 Duncan의 다중비교로 p<0.05에서 결과 간의 유의성을 검정하였다.
성능/효과
3은 추출방법에 따른 어종별 회수율을 살펴보았다. LE, LLE에서 가물치, 새우의 MG 및 LMG 회수율이 다른 어종보다 높게 나타났으며 방어, 송어는 낮게 나타났다. 이러한 차이는 어종이 가지고 있는 고유의 matrix 특성 및 추출 방법에 따른 차이로 사료된다.
정량하기 위하여 LE, LLE 및 SPE 방법을 어종별로 살펴보았다. LE는 간단하면서 빠른 시간에 전 처리가 가능하지만 회수율이 낮게 나타났으며 LLE는 MG 및 LMG의회수율이 좋게 나타났지만 어종에 따른 회수율 차이가 나타났다. SPE에서는 MG의 회수율이 30% 미만이지만 LMG는 80% 이상으로 나타났다.
68% (가물치)로 나타났다. LLE의경우 대체로, LE보다 회수율이 높게 나타났으며 MG 및 LMG 의 회수율이 양호하였다. Choi et al.
MG 및 LMG의 혼합 용액을 각각 0.1, 0.2, 0.5, 1.0 그리고 2.0mg/L의 농도로 희석하여 HPLC로 분석한 다음 농도 대에 따른 peak 면적비를 이용하여 표준곡선을 작성한 결과 MG의 R2값은 0.9993, LMG은 0.9997로 매우 양호한 직선성을 나타내었다 (Fig. 1).
것 이 다. MG는 49.87 (송어 )에 서 72.53%(새 우), LMG는 41.71(방어)에서 71.60% (가물치)로 나타났는데, 대체로 LMG 보다 MG의 회수율이 높게 나타났다. 또한 어종별 회수율을 살펴보면, 지질 함량이 낮은 어종일수록 회수율이 높게 나타났다.
MG를 -20 °C 에서 보관하면 6개월 안에 20%의 감소를 보였으며 50 建/kg보다는 500“g/kg가 더 안정하였으며 LMG는 -20 °C 에서 6개월 동안 큰 변화가 없었지만 4°C에서 보관한 MG 및 LMG 는 4일 안에 60%의 감소를 보인다고 하였다. 따라서 빛에 의해 쉽게 산화되는 MG의 경우, ascorbic acid를 첨가하면 안정성을 높일 수 있을 것으로 생각된다.
60% (가물치)로 나타났는데, 대체로 LMG 보다 MG의 회수율이 높게 나타났다. 또한 어종별 회수율을 살펴보면, 지질 함량이 낮은 어종일수록 회수율이 높게 나타났다. Sanders et al.
(2005)은 SCX SPE을 이용하여 visible/fluorescence detec- tion으로 잉어의 MG 및 LMG 회수율을 살펴본 결과, MG는 62%, LMG는 90%로 보고하였다. 본 연구에서, SPE를 사용한 MG의 회수율은 낮게 나타났지만 LMG의 회수율은 높게 나타났다. MG는 수산 동물의 조직 내에서 LMG 형태로 존재하기 때문에 LMG를 MG의 불법 사용의 표지물질로 이용하고 있다.
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