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문제 정의
- 4에 도시하였다. 효모의 최적 생장 온도인 28℃보다 낮은 온도에서 천천히 CalA를 발현할 경우 단백질의 3차원 접힘 (folding)이 천천히 일어나게 되고, 이로써 정확하고 정교한 접힘 구조의 CalA가 발현되어 높은 활성을 나타낼 것을 예상하였으며 본 연구에서 실험으로 증명하고자 하였다. Fig.
제안 방법
- Candida antractica ATCC 32657 유래 lipase A (CalA)를 얻기 위해 YPD 액체배지 (1% yeast extract, 2% peptone, 2% dextrose)에서 180 rpm, 30℃에서 3일간 배양한 후, 유리 bead (0.75~ 1.00 mm)를 이용해 세포를 깨고 원심분리를 하여 추출했다. Gemonic DNA 를 주출 한 후 Table 1 에서와 같이 Nde I/EcoR I 제한효소가 포함된 primer와 EcoR UNot I 제한효소가 포함된 primer를 각각 이용하여 PCR를 수행하였다.
- 00 mm)를 이용해 세포를 깨고 원심분리를 하여 추출했다. Gemonic DNA 를 주출 한 후 Table 1 에서와 같이 Nde I/EcoR I 제한효소가 포함된 primer와 EcoR UNot I 제한효소가 포함된 primer를 각각 이용하여 PCR를 수행하였다.
- Genomic C. antarctica DNA로부터 propeptide 부분을 제외한 CalA (1296 bp)의 유전자를 PCR로 증폭하였고 pColdm, pPICZaA plasmid에 삽입하여 재조합 pColdHI/ CalA, pPICZaA/CalA, pPICZaA/CalA-his><6를 구축하였다. ClustwerW 프로그램(12)을 이용하여 기존에 발표된 CalA의 서열 (PDB ID : 2VEO)과 비교한 결과 99%의 sequence homology를 나타내었으며 재조합 CalA의 227번째 아미노산이 세린 (serine)에서 글리신 (glycine)으로 변화 한 것을 확인 하였다(13, 14).
- 본 연구에서는 Candida antarcticaSere\ genomic DNA을 추출하여 lipase A(CalA) 유전자를 PCR 증폭하였고, 재조합 pColdHI/CalA, pPICZaA/CalA, pPICZaA/CalA-hisx6을 구축하였다 재조합 CalA 유전자의 기능적 발현을 위해 최적화된 시스템을 구죽하고자 Escherichia co/z:와 Pichia pastoris 시스템에서 각각 수행하여 비교, 분석하였다. SDS PAGE gel을 통해 CalA의 발현의 여부 및 발현양을 확인 하였고, pNPP를 기질로 한 가수분해 반응을 통해 활성을 측정하였다. E.
- p. 必에서 발현된 CalA 시료를 회수하기 위해 5000 g로 원심분리 한 후 상등액을 채취하였다 반면 E. c泌에서 발현된 CalA 시료를 회수하기 위해 먼저 5000 g로 원심분리 한 후 상등 액을 제거하고, bugbuster (2.5 mL/50 mL broth, Novagen, USA)를 첨가하여 재현탁하고 다시 원심분리 한 후 상등액 을 채취하였다. 각 채취된 시료 10(1L를 pNPP reaction solution (10 mM para-nitrophenyl palmitate : EtOH : 50 mM Tris-HCl = 95 : 4 : 1, pH 8.
- 5 mL/50 mL broth, Novagen, USA)를 첨가하여 재현탁하고 다시 원심분리 한 후 상등액 을 채취하였다. 각 채취된 시료 10(1L를 pNPP reaction solution (10 mM para-nitrophenyl palmitate : EtOH : 50 mM Tris-HCl = 95 : 4 : 1, pH 8.0) 3 ml®] 첨가하여 30분 동안 반응시킨 후 UV-visible spectrophotometer (Shimadzu 1650PC, Japan)를 사용하叫 OD405 값을 측정하였다 1 Unit는 45℃ 에서 1분 동안 pNPP를 가수분해하여 1 网이의 pNP (p-nitrophenol)을 방출하는 효소의 양으로 정의하였다.
- 구축된 pColdlU/CalA는 ampicillin (100 /zg/mL) 이 함유 된 LB (10 g/L tryptone, 10 g/L NaCl, 5 g/L yeast extract, 15 g/L agar) 고체배지를 이용하여 E. coli OrigamiB (DE3)에서 형질전환 및 선별이 수행되었다. 선별된 형질 전환체를 50 mL 13响액체배지에서 접종하였고, OD600 값이 0.
- 구축된 pPICZaA/CalA, pPICZaA/CalA-his><6는 BstX I 으로 절단하여 선형화한 후 eletropomtion방법으로 P. pastoris X-33 숙주세포의 genome AOX1 region에 integration 시켰다. 형질전환체를 zeocin (100 陽/mL)이 함유된 YPDS (1% yeast extract, 2% peptone, 2% dextrose, 1 M sorbitol, 2% agar)고체배지에서 선별하였고 50 mL의 BMMY (1% yeast extract, 2% peptone, 100 mM potassium phosphate pH 6, 1.
- 그러나 목적 단백질에 따라 발현 시 IPTG 최적농도가 결정 된다. 본 연구에서 LBamp발현배지에 IPTG의 최종농도를 0.01-10 mM로 첨가하여 각각의 활성과 발현양을 측정하 였고 Fig. 3에 도시하였다. 최종농도 0.
- 본 연구에서는 Candida antarcticaSere\ genomic DNA을 추출하여 lipase A(CalA) 유전자를 PCR 증폭하였고, 재조합 pColdHI/CalA, pPICZaA/CalA, pPICZaA/CalA-hisx6을 구축하였다 재조합 CalA 유전자의 기능적 발현을 위해 최적화된 시스템을 구죽하고자 Escherichia co/z:와 Pichia pastoris 시스템에서 각각 수행하여 비교, 분석하였다. SDS PAGE gel을 통해 CalA의 발현의 여부 및 발현양을 확인 하였고, pNPP를 기질로 한 가수분해 반응을 통해 활성을 측정하였다.
- coli OrigamiB (DE3)에서 형질전환 및 선별이 수행되었다. 선별된 형질 전환체를 50 mL 13响액체배지에서 접종하였고, OD600 값이 0.6-L0에 도달할 때까지 배양한 후 30분 동안 15℃에서 cold 아lock을 주었고 IPTG의 최종농도를 0.01-10 mM로 유도 (Induction)하여 15℃에서 24시간 동안 발현하였다.
- 伊Wcgs에서 Chaetomium thermophilum 유래 glucoamylase(8), Human ScFv against Botulinum Neurotoxin A(9), manganese lipoxygenase (30 mg/L)(10), Aspergillus niger 유래 phytase (65 unit/mL)(l 1)등의 외래 단백질이 성공적으로 발현되었다. 이에 본 연구는 C. antarctica 유래 의 lipase A (CalA)를 P. postoris와 E. c湖에서 발현을 시도하였고, 각 경우의 발현시스템으로서의 유용성 여부에 대하여 비교분석하였다.
- pastoris X-33 숙주세포의 genome AOX1 region에 integration 시켰다. 형질전환체를 zeocin (100 陽/mL)이 함유된 YPDS (1% yeast extract, 2% peptone, 2% dextrose, 1 M sorbitol, 2% agar)고체배지에서 선별하였고 50 mL의 BMMY (1% yeast extract, 2% peptone, 100 mM potassium phosphate pH 6, 1.34% YNB, 4 x IO-5% biotin, 0.5% methan이)배지 로 28℃ 에서 20시간 동안 배양한 후 5% (v/v) methanol® 첨가하여 유도한 후 24시간 동안 발현하였다.
대상 데이터
- 본 연구에서 Cal A의 활성은 pNPP (p-nitrophenyl palmitate)를 기질로 선택하여 측정하였다. p.
- 제한효소 (Takara, Japan), HS LA Taq (Takara, Japan), 리가아제 (New England BioLabs, USA)가 사용되었으며, electroporation을 위해서 Gene Pulser Xcell™ (Bio-Rad, USA)을 사용하였다. 숙주는 E. coli Origami™ B (DE3) (Novagen, Germany), P. pastoris X-33 (Invitrogen, USA)이 사용되었으며, 발현벡터는 pColdDI (Takara, Japan), pPICZaA (Invitrogen, USA)가 사용되었다.
- 제한효소 (Takara, Japan), HS LA Taq (Takara, Japan), 리가아제 (New England BioLabs, USA)가 사용되었으며, electroporation을 위해서 Gene Pulser Xcell™ (Bio-Rad, USA)을 사용하였다. 숙주는 E.
성능/효과
- 28℃ 에서 배양한 경우에는 24시간 이후부터 92시간까지 비활 성 값이 크게 변하지 않았으며, 오히려 48시간 배양하였 을 때는 약간 감소하기도 하였다. 24-48시간 사이에서는 미생물의 생장속도가 목적 단백질의 전사속도에 비해 상대적으로 빠른 것을 간접적으로 확인할 수 있었다. 28℃의 배양조건은 숙주인 P.
- antarctica DNA로부터 propeptide 부분을 제외한 CalA (1296 bp)의 유전자를 PCR로 증폭하였고 pColdm, pPICZaA plasmid에 삽입하여 재조합 pColdHI/ CalA, pPICZaA/CalA, pPICZaA/CalA-his><6를 구축하였다. ClustwerW 프로그램(12)을 이용하여 기존에 발표된 CalA의 서열 (PDB ID : 2VEO)과 비교한 결과 99%의 sequence homology를 나타내었으며 재조합 CalA의 227번째 아미노산이 세린 (serine)에서 글리신 (glycine)으로 변화 한 것을 확인 하였다(13, 14).
- pastoris 시스템에서, pPICZaA/CalA와 histidine을 tagging한 pPICZaA/CalA-hisx6를 각각 발현하였다. SDS PAGE Gel 분석 시 3, 방향에 tagging한 경우에는 밴드의 확인이 어려울 만큼 발현양이 적었으며 활성 또한 wild type보다 7배가 낮았다. pPICZaA 발현 플라스미드는 Saccharomyces cereviriae로부터 유래된 a-factor를 포함 하고 있어 분비작용 (secretion)을 유도함으로써 목적 단백질 의 발현을 향상시키고 회수를 용이하게 한다.
- 7 Unit/M으로 가장 높았다. 결론적으로 CalA의 기능적 발현을 위해 P. pastoris 시스템을 구축하는 것이 가장 적합함을 확인하였다
- 실제 본 연구결과에서도 온도에 따라 약간의 비활성이 차이를 보이지만 미미한 수준으로 고려된다. 결론적으로 lipase A의 경우, 28℃ 배양조건을 이용해도 목적단백질의 발현 및 분비가 원활하게 이루어지는 것을 확인하였다.
- 74 U/ml에 도달하는 것을 확인할 수 있었다. 그러나 15℃ 에서 배양되는 경우에 상대적으로 미생물의 생장속 도가 느리기 때문에 발현양이 불충분하여 낮은 활성 값이 측정될 수 있으므로 단위세포 농도 당 활성을 비교하기 위해 활성 값을 ODso에서 측정한 cell density로 나누어 비활성 (specific activity, Units/ODajo)을 계산하였다 15℃ 에서 배양한 경우 전반적으로 28 ℃ 에서 보다 높은 비활성을 나타내었으며, 72시간 배양하였을 때 최고 0.05 U/OD600 값을 보였고 그 이후로는 오히려 감소하였다. 배양이 진행 됨에 따라 탄소원인 글루코즈 (glucose)가 고갈되어 미생물 의 생장주기가 정상기에서 사멸기로 접어들면서 lipase A의 발현저하현상으로 인해 비활성 값이 감소하였다.
- 02 Unit/ml。로 비교적 낮았으며 세포질 (cytoplasm) 에서 발현되므로 비목적 단백질과의 분리 및 정제과정이 필요하다. 재조합 pPICZ(xA/CalA을 P. pastoris 시스템에서 발현한 경우 높은 발현양 뿐만 아니라 분비작용으로 인해 고순도 발현이 용이하였고, 활성 또한 약 0.7 Unit/M으로 가장 높았다. 결론적으로 CalA의 기능적 발현을 위해 P.
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