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문제 정의
- 우리나라는 김치와 장류 등 전통적으로 자연 미생물을 이용한 발효식품이 풍부할 뿐만 아니라 이들 식품이 국민건강을 좌우하는 기초식품이라고 할 수 있다. 따라서 본 연구에서는 새로운 박테리오신을 생산하는 세균을 분리하기 위한 목적으로 우리나라 고유의 전통 발효식품인 간장으로부터 박테리오신 생산균을 분리하고, 박테리오신 생산을 위한 이 균주의 배양조건 확인 및 분리균주가 생산하는 박테리오신의 물리 . 화학적 특성을 조사하고 정제한 후 tridne-SDS-PAGE로 분자량을 추정하였다.
가설 설정
- 1)Final concentration of solvent was 50% (v/v).
제안 방법
- 상둥액의 항균활성을 검증하기 위해 paper disc method [3]를 사용하였다. 0.5% yeast extract/} 함유된 2.0% agar plate 위에 30℃에서 15시간 배양한 Micrococcus Iuteus 배양액을 0.8% 한천을 함유한 enriched nutrient broth (NB) soft agar에 1% 접종하고 여기에 1 M phosphate buffer (pH 7.0)를 1/10 부피로 첨가 및 혼합하여 plate당 10 ml 씩 분주하여 test plate를 제조하였다. 분리 균주의 배양 상등액을 paper disc (Toyo, 8 mm) 에 30 μ1 씩 loading하여 UV로 10분간 조사한 후, test plate 위에 paper disc를 올려 30℃에서 24시간 배양하여 paper disc주위의 지시균주에 대한 저해환의 생성유무를 관찰하였다.
- 정제한 시료를 tricine sample buffer와 1:1의 부피 비율로 혼합하여 95℃에서 3분간 가열하였다. 4—20% gradient polyacrylamide gel에서 125 V로 2시간 전기영동을 실시하였다. 전기영동이 종료된 후 유리판으로부터 gel을 분리하여 하나는 polypeptide fixative solution (40% methanol, 10% acetic add) 에 30분간 담군 후에 0.
- 역가에 미치는 영향을 조사하였다[14, 19]. 600 nm에서 배양액의 흡광도를 측정하여 균주의 생육도를 조사하였다.
- Chloroform, isopropanol, methanol, ethanol, acetone 및 acetonitrile 등을 배양 상둥액과 같은 부피 비율로 혼합(1:1)하여 용매의 최종 농도를 50%로 맞추고 상온에서 1시간 배양한후, 잔존하는 박테리오신의 항균활성을 측정함으로써 여러 유기용매에 대한 박테리오신의 안정성을 조사하였다[2, 8].
- MRS 고체배지에 생성된 집락의 모양과 크기 둥 형태학적인 특징에 따라 상이한 30주를 분리하여 5 ml의 MRS 액체배지에서 37℃에서 24시간 배양하여 회수한 배양 상둥액을 대상으로 paper disc법으로 항균활성을 나타내는 시료 5주를 일차적으로 선별하였다. 이 중 항균범위가 상대적으로 넓으며 proteinase K를 처리할 경우 항균활성이 상실되는 단백질성 항균물질인 박테리오신을 생산하는 한 균주를 최종적으로 선별하였다.
- MRS 액체배지 초기 pH를 5.0, 6.0, 7.0 및 8.0로 보정하여 37℃에서 48시간 배양하면서 4시간 간격으로 분리균주의 생육도와 박테리오신 역가에 미치는 영향을 조사하였다[14, 19].
- pH에 대한 박테리오신의 안정성을 조사하기 위하여 pH3.0 (0.1 M citrate buffer), pH 5.0 (0.1 M acetate buffer), pH 7.0 (0.1 M phosphate buffer), pH 9.0 (0.1 M borate buffer) 및 pH 11.0 (0.1 M carbonate buffer)의 완충용액과 배양 상둥액을 1:1로 혼합하여 24시간 상온에서 반응시킨 후 잔존하는박테리오신의 항균 활성을 측정하였다 [2罔.
- Retention time (RT)이 서로 다른 7개의 주요한 peak가 나타났다. 각 peak 별로 분획을 회수하여 M latent 대한 생육 저해 여부를 조사하였다. 회수한 7개의 분획 중 RT가 약 18.
- 배양 상둥액에 준비된 각종 효소를 2 mg/ml의 농도로 첨가하고 37℃에서 150분간 그리고 proteinase K는 45℃에서 12시간 반응시켰다. 남아있는 박테리오신활성은 M. 血曲에 대한 저해환의 직경을 측정하였다. 또한동일한 조건에서 효소액만을 처리하지 않은 것을 음성 대조구로 사용하였다[2, 8, 12, 20].
- , Pedocoocus dextiinicus 및 Xhanthamnas sp. 등을 시험균주로 사용하여 저해환의 형성 유무를 조사하였다 [2, 18].
- 박테리오신 생산균주의 생화학적 특성을 조사하기 위해 API 50 CHB kit(Bio-Merieux, France)를 이용하여 당 발효 및이용성을 확인하였으몌8, 9], 유전학적 동정을 위해서 16S rRNA의 염기서열을 분석한 후, 염기서열을 기초로 하여 분자계통학적 분류도 병행하였다.
- 용출된 분획들에대해 Minted 대한 생육저해 여부를 조사한 결과, 최대 활성을 나타내는 분획은 99, 100번 이었으며, 용출된 분획 중 93~102번째 분획에서 항균활성이 나타났다. 박테리오신의활성을 보이는 분획들만 모아 투석 및 동결 건조하여 이후실험에 사용하였다.
- 배지의 초기 pH에 따른 세포생장과 박테리오신 생산에 미치는 영향을 조사하였다(Fig. 2). 초기 pH 5.
- 0)를 1/10 부피로 첨가 및 혼합하여 plate당 10 ml 씩 분주하여 test plate를 제조하였다. 분리 균주의 배양 상등액을 paper disc (Toyo, 8 mm) 에 30 μ1 씩 loading하여 UV로 10분간 조사한 후, test plate 위에 paper disc를 올려 30℃에서 24시간 배양하여 paper disc주위의 지시균주에 대한 저해환의 생성유무를 관찰하였다. 저해 환을 생성하는 균주들의 박테리오신 확인은 상둥액을 proteinase K로 처리하여 항균활성이 사라지는지 여부로 하였다.
- 분리균주를 25℃, 30℃, 37℃에서 50 ml의 MRS 액체배지에서 48시간 배양하면서 4시간 간격으로 분리균주의 생육과 박테리오신 역가에 미치는 영향을 조사하였다[14, 19]. 600 nm에서 배양액의 흡광도를 측정하여 균주의 생육도를 조사하였다.
- 수집한 간장 시료를 멸균된 생리식염수에 10배씩 단계별로 연속 희석하여 LactdbadlliV)e Man, Rogosa and Sharpe (MRS) 한천배지에 도말한 후 37℃에서 집락이 형성될 때까지 배양하였다. 나타난 집락을 형태학적 특성에 따라 일차적으로 분류하였다.
- 수집한 간장시료에서 형태학적인 특성에 따라 상이한 30주의 미생물을 분리하고 MRS 액체배지에서 37℃, 24시간 배양한 후 회수한 배양 상등액 중 paper disc법으로 항균 활성이 있는 것을 일차 선별하여 proteinase K 처리에 의해 항균 활성이 사라지는 시료 하나를 최종적으로 선별하였다. 선별한 분리 주를 생화학적 분류와 분자계통학적 분류를 통해 동정한 결과 B.
- 열에 대한 박테리오신의 안정성을 조사하기 위하여 배양 상둥액을 20, 40, 60, 80 및 100℃에서 각각 30 또는 60분간 열처리한 후 잔존하는 박테리오신의 항균활성을 측정하였다 [2, 8].
- 1% TFA)를 0~100%까지 linear gradient, 그리고 그 다음 5분간은 100% Buffer B로 용출시 켰다. 유속은 2.0 ml/minS 유지하였고, 각 peak 별로 회수한 분획의 박테리오신 활성을조사하였고 박테리오신 활성이 있는 분획을 모아서 용매를 증발시킨 후 50 mM 인산 완충액(pH 6.0)에 용해시켰다[12].
- 이온교환크로마토그래피에서 얻은 항균활성 분획을 투석 및 동결건조시 킨 후 3차 증류수에 용해시 켜 역상 HPLC를 통해 박테 리오신을 정제하였다. C18 column에서 박테 리오 신의 분리는 한번 행해졌고 이때의 크로마토그램은 Fig.
- 분리 균주의 배양 상등액을 paper disc (Toyo, 8 mm) 에 30 μ1 씩 loading하여 UV로 10분간 조사한 후, test plate 위에 paper disc를 올려 30℃에서 24시간 배양하여 paper disc주위의 지시균주에 대한 저해환의 생성유무를 관찰하였다. 저해 환을 생성하는 균주들의 박테리오신 확인은 상둥액을 proteinase K로 처리하여 항균활성이 사라지는지 여부로 하였다. 박테리오신 역가는 activity unit (AU)로 표기하였고 상둥액을순차적으로 2배씩 희석하여 저해환을 형성하는 최대 희석배수의 역수를 취하고, 이 값에 1 ml에 대해서 환산해 주는 환산계수를 곱하여 AU/ml로 나타내었다[15, 19].
- 정제한 박테리오신의 순도와 분자량을 추정하기 위해 tridne SDS-PAGE를 실시하였다[20, 24]. 정제한 시료를 tricine sample buffer와 1:1의 부피 비율로 혼합하여 95℃에서 3분간 가열하였다.
- 4℃)하였다. 침 전물만을 회수하여 10 mM sodium phosphate buffer (pH 6.0) 40 ml에 녹이고, MWCO가 1000인 투석막(Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA, USA)을 사용하여 4℃에서 동일한 buffer 2 1에서 하룻밤 투석시 켜 항균활성을 확인하였다 [12, 13, 15, 18].
- 항균물질을 20~100℃ 범위에서 일정 시간 배양하여 열 안정성을 조사하였다(Table 3).
- 5 ml씩 받았다. 항균활성이 있는 분획을 합치고 증류수에서 투석을 행하여 NaCl을 제거한 후 동결건조로 농축하였다 [9, 12, 13, 15, 18].
- 따라서 본 연구에서는 새로운 박테리오신을 생산하는 세균을 분리하기 위한 목적으로 우리나라 고유의 전통 발효식품인 간장으로부터 박테리오신 생산균을 분리하고, 박테리오신 생산을 위한 이 균주의 배양조건 확인 및 분리균주가 생산하는 박테리오신의 물리 . 화학적 특성을 조사하고 정제한 후 tridne-SDS-PAGE로 분자량을 추정하였다.
- 황산암모늄 침전법으로 농축한 시료를 양이온 교환수지인 SPSepharose를 사용하여 이온교환 크로마토그래피를 실시하였다(Fig. 3). 황산암모늄 분획을 칼럼에 통과시킨 후 칼럼의 5배의 부피에 해당하는 50 mM sodium phosphate buffer(pH 6.
대상 데이터
- 1% Coomassie brilliant blue R-250 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) 으로 2시간 염색한 후 methanokacetic add:water (1:1:8, v:v:v) 용액으로 2시간 탈색하였다. 단백질 표준물질로는 BioRad사의 polypeptide SDS-PAGE molecular weight standards marker를 사용하였다. 나머지 gele 증류수를 30분마다 교체하면서 5회 세척하였다.
- 단백질, 탄수화물 및 지질 가수분해 효소 등을 Sigma- Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구입하여 제조사의 지침에 따라 사용하였다. Lipase (4307 U/mg) 와 trypsin (13, 500 U/mg)은 50 mM Tris-HQ buffer (pH 7.
- 이 중 항균범위가 상대적으로 넓으며 proteinase K를 처리할 경우 항균활성이 상실되는 단백질성 항균물질인 박테리오신을 생산하는 한 균주를 최종적으로 선별하였다.
이론/모형
- 1 % TFA solution. The bacteriocin activity of each fraction was determined using the paper disc method.
- 박테리오신의 항균 스펙트럼은 paper disc method를 사용하여 확인하였다. Badllus sp.
- 회수율은 약 83%였다. 분리균주가 생산하는 박테리오신을 정제하기 위하여 배양 상둥액 중의 단백질을 황산암모늄침전법으로 농축시킨 후 이온교환 크로마토그래피와 역상 HPLC< 순차적으로 실시하여 정제를 시도한 결과는 Table 5와 같다.
- 상둥액의 항균활성을 검증하기 위해 paper disc method [3]를 사용하였다. 0.
성능/효과
- 여러 가수분해효소에 대한 내성을 조사한 결과 trypsin, wvh加oKpsin, pepsin, a -amylase 및 carboxypeptidase A 등은 항균활성 에 영향을 주지 않았으나 lipase는 항균활성을 약간 감소시켰으며 proteinase K는 항균활성을 완전히 사라지게 하였다. 75% 황산암모늄 침전, 양이온교환크로마토그래피, 역상 HPLC 등의 과정을 통해 정제된 박테리오신의 상대비활성(specific activity)은 배양상둥액에서 보다 약 75배 증가하였고 회수율은 13.5%였다. 역상 HPLC를 통해서 정제된 박테리오신의 분자량을 tricine SDSFAGE을 통해서 확인한 결과 약 2.
- API 50 kit를 이용하여 탄소원으로 당이나 당유도체의 이용성의 결과를 API 50 kit 제조사의 지침에 따라 on line으로입력하고 분석하여 생화학적인 동정을 행한 결과, 분리균주는 99.9%의 유의성으로 Badlluslicheni&rnis균줌로 확인되었으며, 차 순위로 0.1%의 유의성으로 Badlluspumlu& 동정 되었다(Table 1). 또한 16S rRNA의 염기서 열을 분석한 결과도 분리주가 B.
- 0에 이르는 거의 전 pH 영역에서 20시간이상 처리하여도 그 항균활성을 완전히 잃지 않아 비교적 넓은 pH 범위 내에서 안정함을 알 수 있었다. Acetone, acetonitrile, chloroform, ethanol 처리 및 20~100℃에서 60분간 가열시에도 높은 항균활성을 유지하였다. 여러 가수분해효소에 대한 내성을 조사한 결과 trypsin, wvh加oKpsin, pepsin, a -amylase 및 carboxypeptidase A 등은 항균활성 에 영향을 주지 않았으나 lipase는 항균활성을 약간 감소시켰으며 proteinase K는 항균활성을 완전히 사라지게 하였다.
- 0의 범위에 해당되는 완충액을사용하여 상온에서 24시간 배양한 후 잔존활성을 측정한 결과를 Table 3에 나타내었다. pH 7.0까지의 영역에서 항균활성을유지하여 안정하다는 것을 알 수 있었다. 대부분의 유산균이생산하는 박테리오신은 낮은 pH에서 활성을 보이거나, 매우국한된 범위의 pH에서만 안정한 것으로 알려져 있는데, 그 예로 L pfenfenanC-ll0] 생산하는 plantaridn A는 pH 4.
- B. licheniAmis?} 생산하는 박테리오신은 Badllus sphaaicus, LadcbadUus bulgaricus, Lactobadllus fiantanm, Micrococcus luteus, Paenibadllvs pdy巧va 및 PMococais d知iuiais 둥叭 대해서 항균활성을 보였으며, pH 3.0~ 11.0에 이르는 거의 전 pH 영역에서 20시간이상 처리하여도 그 항균활성을 완전히 잃지 않아 비교적 넓은 pH 범위 내에서 안정함을 알 수 있었다. Acetone, acetonitrile, chloroform, ethanol 처리 및 20~100℃에서 60분간 가열시에도 높은 항균활성을 유지하였다.
- 천연의 항균성 단백질이다. 둘째, 항생제의 경우 사람에게 투여 시 체내 축적과 같은 부작용을 초래하지만 박테리오신은 천연의 항균성 단백질로서, 분자가 아미노산으로 구성되어 있기 때문에 일반적으로 인체에 섭취되면 소화기관의 단백질가수분해효소에 의해 쉽게 분해되어 인체에 무독성이고 잔류성이 없을 뿐만 아니라, pH와 열에 대한 안정성이 높다. 이러한 측면에서 볼 때 박테리오신은 식품의 새로운 생물보존제로서, 식품의 제조공정 및 완제품 등에 응용되어 그 효용성이 크게 기대되고 있다[11].
- 0에서 역가의 약 50% 수준을 나타내었다. 따라서 분리균주의 박테리오신 생산을 위한 배지의 최적 초기 pH는 7.0임을 확인하였다.
- 항균활성이 각각 50%로 감소하였다(Table 3). 따라서 시험한 용매 중 methanol과 isopropanol을 제외한 용매에 대해서는 안정하였으나 methanol과 isopropancde 박테리오신의 항균 활성을 감소시켜 HryLC를 통한 박테리오신의 정제용 용매로는 부적합함을 알 수 있었다.
- 5 kDa인 분자량을 가지는 것으로 추정할수 있었다. 또한 전기 영동한 겔을 중류수로 30분간 5회 세척한 후 M. lutecsA 접종된 NB soft agar를 중층하여 박테리오신의 활성을 조사한 결과 위의 염색한 겔의 band와 일치하는곳에 강한 억제환이 생겨 박테리오신임을 확인할 수 있었다. 기존의 보고된 B.
- 그리고 pH에 의하여 항균물질이 활성을 상실하는 이유는 pH가 높을 경우 hydroxides ions, deprotonated amines, deprotonated hydroxyl group과 같은 nucleophilee dehydro residue와 반응하여 분자 간 혹은 분자 내 crossJinkage를 형성 하여 화학적 변형을 일으키기 때문인 것으로 보고되었다[14, 22]. 본 연구에서 분리균주로부터 생산되는 박테리오신은 pH 3.0~ 11.0에 이르는 거의 전 pH 영역에서 20시간 이상 처리하여도 그 활성을 완전히 잃지 않아 비교적 넓은 pH범위 내에서 안정함을 알 수 있었다.
- 부분 정제한 박테리오신 용액에 여러 종류의 가수분해효소를 2 mg/ml의 농도가 되도록 첨가하여 반응시킨 후 항균물질의 잔존활성을 측정한 결과, proteinase K에 의해서는 항균 활성이 완전히 소실되어 항균 활성물질이 단백질성 물질 즉 박테리오신임을 확인할 수 있었다(Table 4). 일부 단백질 분해효소에 의해 활성이 소실되지 않은 것은 리신, 아르기닌, 페닐알라닌, 타이로신, 카르복실기 c-말단, 등과 같은 특이적인 절단 부위가 없거나 반응시킨 효소농도의 문제로 추정되며, lipase 를 2 mg/ml의 농도로 처리했을 때 활성의 일부를 잃어 지질성 물질이 항균활성에 관여하는 것으로 추정된다.
- 분리균주를 MRS 액체배지에서 37℃, 36시간 배양한 후 원심분리하여 얻은 배양상둥액의 박테리오신 활성은 66 AU/ml 이었고, 황산암모늄 침전법으로 부분 정제한 박테리오신 활성은 528 AU/ml으로 나타나 배 양 상둥액에 비해 약 8배 증가되었고 회수율은 약 83%였다. 분리균주가 생산하는 박테리오신을 정제하기 위하여 배양 상둥액 중의 단백질을 황산암모늄침전법으로 농축시킨 후 이온교환 크로마토그래피와 역상 HPLC< 순차적으로 실시하여 정제를 시도한 결과는 Table 5와 같다.
- 분리주가 생산하는 박테리오신은 Bacillus etiaericus, Laddbadllus bulgaHcus, Laddbadllus piantannn Microcoocus lu- teus, PaenibadHus pdymyxa 및 Pediococcus dextrinicus 등 주로 그람 양성균에 대해서 항균활성을 나타내었으나 대장균(E.coil)과 같은 그람 음성균에는 항균활성이 없었다.
- 5에서 보는 바와 같이 정제된 박테리오신은 단일밴드를 나타내어 순수한 형태로 정제되었음을 알 수 있었다. 분자량 표준시료와비교한 결과 약 2.5 kDa인 분자량을 가지는 것으로 추정할수 있었다. 또한 전기 영동한 겔을 중류수로 30분간 5회 세척한 후 M.
- 사라지는 시료 하나를 최종적으로 선별하였다. 선별한 분리 주를 생화학적 분류와 분자계통학적 분류를 통해 동정한 결과 B. HcheniArnne 나타났다. 이 균주의 생장온도와 배지의 초기 pH에 따른 세포생장 및 박테리오신 활성을 조사한 결과 배양온도는 37℃, 배지의 초기 pH는 7.
- Acetone, acetonitrile, chloroform, ethanol 처리 및 20~100℃에서 60분간 가열시에도 높은 항균활성을 유지하였다. 여러 가수분해효소에 대한 내성을 조사한 결과 trypsin, wvh加oKpsin, pepsin, a -amylase 및 carboxypeptidase A 등은 항균활성 에 영향을 주지 않았으나 lipase는 항균활성을 약간 감소시켰으며 proteinase K는 항균활성을 완전히 사라지게 하였다. 75% 황산암모늄 침전, 양이온교환크로마토그래피, 역상 HPLC 등의 과정을 통해 정제된 박테리오신의 상대비활성(specific activity)은 배양상둥액에서 보다 약 75배 증가하였고 회수율은 13.
- 5%였다. 역상 HPLC를 통해서 정제된 박테리오신의 분자량을 tricine SDSFAGE을 통해서 확인한 결과 약 2.5 kDa으로 나타났으며 염색 시 단일 band로 나타나 순수하게 정제되었음을 확인하였다.
- 0 M)에 의해칼럼으로부터 결합된 단백질을 용출시켰다. 용출된 분획들에대해 Minted 대한 생육저해 여부를 조사한 결과, 최대 활성을 나타내는 분획은 99, 100번 이었으며, 용출된 분획 중 93~102번째 분획에서 항균활성이 나타났다. 박테리오신의활성을 보이는 분획들만 모아 투석 및 동결 건조하여 이후실험에 사용하였다.
- 유기용매에 대한 내성의 경우 50%(v/v)의 acetone, acetonitrile, chlorofarm 및 ethanol 등에 대해서는 매우 안정하였으나, isopropan이과 methanol 등을 최종 농도 50%(v/v) 처리할 경우 항균활성이 각각 50%로 감소하였다(Table 3). 따라서 시험한 용매 중 methanol과 isopropanol을 제외한 용매에 대해서는 안정하였으나 methanol과 isopropancde 박테리오신의 항균 활성을 감소시켜 HryLC를 통한 박테리오신의 정제용 용매로는 부적합함을 알 수 있었다.
- HcheniArnne 나타났다. 이 균주의 생장온도와 배지의 초기 pH에 따른 세포생장 및 박테리오신 활성을 조사한 결과 배양온도는 37℃, 배지의 초기 pH는 7.0에서 박테리오신의 활성이 가장 높게 나타났다. B.
- 위 실험 결과의 재현성 확인을 위하여 2차, 3차 실험을 실시하여 동일한 결과를 얻었다[22]. 이렇게 정제된 박테리오신의 최종 상대비활성 (specific activity)은 배양 상등액보다 약 75배 증가하였고, 회수율은 13.5%였다.
- 나타내었다. 이를 토대로 분리균주가 생산하는 박테리오신은 비교적 열에 안정함을 알 수 있었다. Lactobacillus 생산하는 lactadn B의 경우 120℃에서 60분 동안 열처리에도 안정하였으며[21], Lactaxxxus.
- 37℃에서 배양 하였을 때는 배양 후 %시간 만에 264 AU/ml로 가장 높은 박테리오신 역가를 나타내었으며, 이후 48시간까지 계속 유지되었다. 이상에서 박테리오신 최적 생산온도는 37℃, 그리고 배양시간은 36시간 이상임을 알 수 있었다.
후속연구
- 5 kDa으로 휠씬 작음을 알 수 있었으며구조적인 분석은 하지 않아 알 수 없으나 기존의 박테리오신과는 다른 구조일 것으로 생각된다[2, 14]. 따라서 아미노말단의 아미노산서열과 같은 추가적인 연구의 수행이 필요할 것으로 판단된다.
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