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문제 정의
- 산마늘의 소비확대 및 가공품 생산을 위한 기초 자료를 수집하기 위해 아미노산 함량과 생리활성 효과를 조사하였다. 산마늘 잎에서는 17종류의 구성아미노산과 38종류의 유리아 미노산이 분리되었으며, 총 함량은 각각 2,693.
- 이와 같은 배경에서 본 연구는 식품으로서 산마늘의 이용 및 가공상품 등 이용성을 높이데 필요한 기초자료를 확보하기 위하여 전남에서 채취한 산마늘의 아미노산 함량, 생리활성 효과 및 추출물의 암세포 증식억제 효과를 조사 했다.
제안 방법
- 1×10 -4 M DPPH와 농도별 추출물을 각각 100 μL씩 취하여 혼합하고, 30분간 암 상태에서 방치한 후 ELISA Reader(Bio-RAD, USA)를 이용하여 517 nm에서 잔존 라디칼 농도를 측정하였다.
- 완전히 가수분해 후 약간의 순수로 튜브를 씻어 농축수기로 옮기고 산 냄새가 나지 않을 때까지 완전히 건조되게 감압농축 하였다. 건고시킨 시료용액을 Sodium Citrate Loading Buffer(pH 2.2) 로 25 ml 정용한 것을 자동아미노산자동분석기(Biochrom 30, Amersham Biosciences Ltd., England)로 Table 1 의 조건에 따라 분석하였다.
- 여액을 40℃ 이하에서 2-3 ml까지 감압농축 시키고 농축액과 농축수기는 소량의 증류수로 세척하여 분액깔대기로 옮긴 후 diethyl ether 20 ml를 가해 2회 탈지시킨 하층을 농축수기로 옮겨 농축 및 건고 시켰다. 건고시킨 시료용액을 lithium citrate 완충용액(pH 2.2)으로 용해하고 25 ml로 정용한 것을 자동 아미노산 분석기(Biochrom 30, Amersham Biosciences Ltd., England)로 Table 1의 조건에 따라 분석하였다.
- 1 ml 를 잘 혼합시켜 37℃의 water bath에서 1시간 동안 반응 시킨 후 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 공시험은 시료 용액 대신 50% methanol 용액을 동일하게 처리하였으며, 표준곡선은 naringin(Sigma Co., USA)을 이용하여 작성 하고 이로부터 총 플라보노이드 함량을 구하였다.
- 시료는 전남 광양시 옥룡면에서 5월 하순경에 채취한 산마늘의 잎과 뿌리를 이용하였다. 생리활성 검정에 사용한 시료는 잎의 경우 동결건조(-20℃에서 5일간)하였으며, 암세포 증식억제에 사용한 시료는 뿌리로 항온건조(50℃에서 5일간)하였다. 추출은 각 시료 200 g를 2L의 증류수, 에탄올 및 메탄올에 참지 후 열수 추출은 증류수를 이용해 100℃에서 30분간, 에탄올과 메탄올 추출은 94% 용액에 침지하여 25℃에서 24시간동안 추출하였다.
- 시료의 환원력 크기는 라디칼 소거활성(scavenging activity)으로 표시하였고, RC 50 은 DPPH 농도가 1/2로 감소하는데 필요한 시료의 양(μg)으로 나타내었으며 항산화 물질로 잘 알려진 BHT(butylated hydroxytoluene)와 비교하였다.
- 이 반응액을 37℃ 항온수조에서 1시간 반응시킨 후 2% acetic acid 1,000 μL, Griess 시약(30% acetic acid로 조제한 1% sulfanilic acid와 1% naphthylamine을 1:1 비율로 혼합한 것, 사용직전에 조제) 80 μL를 가하여 잘 혼합시켜 빛을 차단한 상온에서 15분간 반응시킨 후 520 nm에서 흡광도를 측정하여 다음과 같이 아질산염 소거능을 구하였다.
- 전자공여능 측정은 DPPH(α,α-diphenyl-β-picrylhydrazyl)법을 이용하여 시료의 라디칼(radical) 소거효과를 측정하는 Blois(1958)의 방법을 약간 변형하여 측정하 였다.
- 즉, “아질산염 소거율(%)={1 -(1 mM NaNO2 용액에 시료를 첨가하여 1시간 반응시킨 후의 흡광도 - 시료자체의 흡광도) / 1 mM NaNO2 용액에 증류수를 첨가하여 1시간 반응시킨 후의 흡광도} × 100”으로 계산하였다.
- 즉, “암세포증식 억제효과(%) = {(대조구의 흡광도 - 시료처리구의 흡광도)/대조구의 흡광도} x 100”으로 하였는데, 각 세포의 시료 무첨가군을 100%로 하여 상대적인 세포 성장율을 환산하였다.
- 즉, 암세포를 3×10 4 cells/ml의 농도가 되도록 조절한 후 96 well microplate 에 90 μL/well씩 분주하고, 이것을 37℃, 5% CO2 세포배 양기(Forma, Germany)에서 12시간 배양하여 세포를 부착 시킨 다음 추출물을 50, 100, 200, 400, 800 mg/L 농도가 되도록 10 μL씩 첨가하였다.
- 생리활성 검정에 사용한 시료는 잎의 경우 동결건조(-20℃에서 5일간)하였으며, 암세포 증식억제에 사용한 시료는 뿌리로 항온건조(50℃에서 5일간)하였다. 추출은 각 시료 200 g를 2L의 증류수, 에탄올 및 메탄올에 참지 후 열수 추출은 증류수를 이용해 100℃에서 30분간, 에탄올과 메탄올 추출은 94% 용액에 침지하여 25℃에서 24시간동안 추출하였다. 암세포 증식 억제에 사용한 것은 50℃에서 24시간 동안 추출하였다.
대상 데이터
- 실험에 사용된 암 세포주는 모두 인체기원의 암 세포주로 Korean Cell Line Bank(KCLB)에서 구입한 위암세포주인 SNU-601과 폐암세포주인 Calus-6(ATCC, HTB-56)을 사용하였다. 세포주의 배양은 10% FBS(fetal bovine serum) 와 peniciline G(25 unit/ml) 및 streptomycin(25 mg/L) 를 첨가한 RPMI 1640 배지를 사용하였으며 37℃, 5% CO2의 습윤화 된 배양기내에서 적응시켜 배양하였다.
- 시료는 전남 광양시 옥룡면에서 5월 하순경에 채취한 산마늘의 잎과 뿌리를 이용하였다. 생리활성 검정에 사용한 시료는 잎의 경우 동결건조(-20℃에서 5일간)하였으며, 암세포 증식억제에 사용한 시료는 뿌리로 항온건조(50℃에서 5일간)하였다.
- 실험에 사용된 암 세포주는 모두 인체기원의 암 세포주로 Korean Cell Line Bank(KCLB)에서 구입한 위암세포주인 SNU-601과 폐암세포주인 Calus-6(ATCC, HTB-56)을 사용하였다. 세포주의 배양은 10% FBS(fetal bovine serum) 와 peniciline G(25 unit/ml) 및 streptomycin(25 mg/L) 를 첨가한 RPMI 1640 배지를 사용하였으며 37℃, 5% CO2의 습윤화 된 배양기내에서 적응시켜 배양하였다.
데이터처리
- 2)Mean separation within columns by Duncan’s multiple range test at 5% level.
- 각각의 조사 분석은 3반복 이상으로 하였으며, 통계처리는 SAS 프로그램 중에서 분산분석(ANOVA)을 실시하여 Duncan’s multiple range test로 5% 유의 수준에서 시료 간의 유의성을 검정하였다.
이론/모형
- 세포독성은 MTT assay(Mosmann, 1983; Choi et al., 1989)에 의해 세포생존율을 조사하였다. 즉, 암세포를 3×10 4 cells/ml의 농도가 되도록 조절한 후 96 well microplate 에 90 μL/well씩 분주하고, 이것을 37℃, 5% CO2 세포배 양기(Forma, Germany)에서 12시간 배양하여 세포를 부착 시킨 다음 추출물을 50, 100, 200, 400, 800 mg/L 농도가 되도록 10 μL씩 첨가하였다.
- 수분은 105℃ 상압가열건조법, 회분은 550℃ 직접회화 법, 조단백질은 자동질소증류장치(KJELTEC 2200 SYSTEM, Foss, HӦganӓs, Sweden)를 이용한 Kjeldahl법, 조지방은 자동지방추출장치(Soxtec Avanti 2055 System, Foss) 를 이용한 Soxhlet 추출법을 사용하였다(Kim et al., 2005). 탄수화물은 시료의 총 중량에서 수분, 단백질, 지방 그리고 회분 함량을 제외한 함량으로 표시하였다.
- 아질산염소거 효과는 Gray와 Dugan(1975)의 방법에 준하여 다음과 같이 측정하였다. 1 mM NaNO2 20 μL에 시료의 추출액 40 μL와 0.
- 총 페놀 화합물 함량은 Folin-Denis 방법(Dewanto et al., 2002)에 따라 분석하였다. 시료를 1 mg/L 농도로 조제한 후, 이 시료액 1 ml에 증류수 3 ml를 첨가하고, FolinCiocalteau’s phenol reagent 1 ml를 첨가한 후 27℃ 진탕 수조에서 혼합하였다.
성능/효과
- 9 mg/L 였다는 Kim 등(2009) 의 보고와 비교 해 볼 때 다소 낮은 수준이었다. 결과적으로 산마늘 잎의 총 페놀함량과 총 플라보노이드 함량은 방아풀, 쑥부쟁이 및 씀바귀에 비해 낮은 수준이었지만 한국산 참다래 4종류의 메탄올 추출물 1,000 mg/L 중의 총 페놀 함량은 5.2-17.3, 총 플라보노이드 함량은 0.0-9.0 mg/L이었다는 Park 등(2008)는 보고와 비교해 볼 때는 다소 높은 수준이었다.
- 18 mm의 저해환 직경을 나타내었다. 결과적으로 열수 추출물은 에탄올 및메탄올 추출물에 비해 사람과 동물에게 수막염, 수막뇌염, 전염성 단백증, 패혈증 등의 증상을 나타내는 원인균주인 Listeria monocytogenes 균(Park et al., 2009)과 폐렴 간균인 Klebsiella pnumoniae에 대해서는 다소 높은 항균 효과를 나타낸 만큼 이용시는 이점을 고려하는 것이 좋을 것으로 사료된다.
- , 1997). 그래서 산마늘의 총 플라보노이드 함량을 조사한 결과 열수, 에탄올및 메탄올 추출물에서 각각 11.6, 21.1 및 22.2 mg/L을나타냈다(Table 6). 이러한 결과는 방아풀, 쑥부쟁이 및 씀바귀 메탄올 추출물 1,000 mg/L의 총 플라보노이드 함량은 각각 25.
- , 2007). 그런 측면에서 산마늘 추출물의 전자공여능에서 RC 50 값을 조사한 결과 에탄올 추출물에서 우수해 963.7 mg/L을 나타냈으며, 메탄올 추출물에서는 1,292.0 mg/L을, 열수 추출물에서는 1,592.7 mg/L을 나타내었다(Table 6). 이러한 결과는 방아풀, 쑥부쟁이 및 씀바귀 추출물의 RC 50 값을 조사한 결과 각각 856.
- Lee 등(1997)은 생마늘 인경의 아미노산 함량을 분석한 결과 총 아미노산 함량은 1059 mg/ 100 g이었으며, 종류별로는 arginine(269 mg/100 g), glutamic acid(177 mg/100 g), aspartic acid(107 mg/ 100 g), threonine(95 mg/100 g)이라고 보고 하였다. 따라서 glutamic acid와 aspartic acid는 산마늘 잎과 생마늘 인경에 공통적으로 많이 함유되어 있는 아미노산이었다. 또 산마늘 잎에 함유된 구성 아미노산 총 함량은 마늘인경에 비해 많았으며, 구성 아미노산 종류별로도 생마늘 인경에 많이 함유된 arginine을 제외하고는 산마늘 잎에 많이 함유된 것들이 생마늘에 함유된 것 보다 많은 것으로 나타 났으므로 이용시는 이를 감안하는 것이 좋을 것으로 사료 된다.
- 따라서 glutamic acid와 aspartic acid는 산마늘 잎과 생마늘 인경에 공통적으로 많이 함유되어 있는 아미노산이었다. 또 산마늘 잎에 함유된 구성 아미노산 총 함량은 마늘인경에 비해 많았으며, 구성 아미노산 종류별로도 생마늘 인경에 많이 함유된 arginine을 제외하고는 산마늘 잎에 많이 함유된 것들이 생마늘에 함유된 것 보다 많은 것으로 나타 났으므로 이용시는 이를 감안하는 것이 좋을 것으로 사료 된다.
- 38 mm를 나타내었다. 메탄올 추출물에서는 추출물 농도가 2,000 mg/L 일 때 4종류 균모두 저해환 직경이 8.99 mm 이하를 나타냈지만 에탄올 추출물에서는 추출물 농도가 2,000 mg/L 일 때 Klebsiella pnumoniae 균과 Listeria monocytogenes 균에서 각각 9.28 및 9.14 mm를 나타내었다. 이들 Klebsiella pnumoniae 균과 Listeria monocytogenes 균은 열수 추출물에서는 1,000 mg/L 농도에서 각각 9.
- 산마늘 인경 메탄올 추출물의 암세포 증식억제 효과를 조사한 결과 폐암세포(Calu-6)에 대해서는 200 mg/L에서, 위암세포(SNU-601)에 대해서는 400 mg/L에서는 99.9% 억제율을 나타내었다(Fig. 1). 이러한 결과는 참다래 메탄올 추출물이 폐암세포주(Calus-6)의 증식억제에 미치는 효과를 조사한 결과 추출물 800 mg/L에서 비단은 21.
- 산마늘 잎 추출물 1,000 mg/L에 함유된 총 페놀 함량은 열수, 에탄올 및 메탄올 추출물에서 각각 25.4, 31.9 및 37.7 mg/L을 나타냈다(Table 5). 페놀성 화합물은 식물 계에 널리 분포되어 있는 2차 대사산물의 하나로 다양한 구조와 분자량을 가지며, phenolic hydroxyl가 단백질 및기타 거대 분자들과 결합하여 항산화 및 항암 등의 다양한 생리활성을 가진다(Heo et al.
- 2%) 순으로 높게 나타났다. 산마늘 잎 추출물 1,000 mg/L에서 아질산염 소거능은 메탄올 추출물(79.5%), 에탄올 추출물(73.8%) 및 열수 추출물(70.9%) 순으로 높았다. 산마늘 인경 메탄올 추출물의 암세포 증식억제 효과는 폐암세포(Calu-6)의 경우 200 mg/L 이상의 농도에서, 위암세포(SNU-601)는 400 mg/L 이상의 농도에서 99.
- 6 mg/L)순으로 많게 나타났다. 산마늘 잎 추출물 1000 mg/L의 DPPH 라디컬 소거능은 에탄올 추출물(51.6%), 메탄올 추출물(47.3%), 열수 추출물(37.2%) 순으로 높게 나타났다. 산마늘 잎 추출물 1,000 mg/L에서 아질산염 소거능은 메탄올 추출물(79.
- 9% 억제율을 나타내었다. 산마늘 잎 추출물의 항균활성은 용매(메탄올, 에탄올 및 열수) 및 추출물 농도(500, 1,000 및 2,000 mg/L)에 따른 차이가 크지 않았으며, 저해환 직경은 그람양성균의 경우 8.23-10.15 mm, 그람음성균은 8.25-9.38 mm를 나타내었다. 이와 같이 조사된 자료는 산마늘의 이용시 기초 자료가 될 것이며, 산마늘의 섭취는 생리활성 효과를 높이고, 폐암과 위암의 예방과 치료에 다소나마 도움이 될 것으로 사료된다.
- 산마늘 잎에 함유된 일반성분은 수분(83.45%), 탄수화물 (10.23%), 조단백질(4.33%), 조지방(1.06%), 조회분(0.93%) 순으로 많았다(Table 2). 산마늘 잎의 일반성분 중에는 2-3% 의 탄수화물과 ascorbic acid이 함유되어 있다(Choi et al.
- 1). 이러한 결과는 참다래 메탄올 추출물이 폐암세포주(Calus-6)의 증식억제에 미치는 효과를 조사한 결과 추출물 800 mg/L에서 비단은 21.1%, 해금은 9.5%, 대흥은 6.7%, 헤이워드는 5.0%의 억제 효과를 나타 냈다는 Park 등(2009)의 보고와 비교해 볼 때 항암효과가 매우 높음을 알 수 있었다. 따라서 본 연구 결과가 비록 기내 실험에 의한 것이지만 암세포 억제율이 높게 나타났기 때문에 산마늘을 식용하면 폐암과 위암의 예방과 치료에 다소나마 도움이 될 것으로 사료된다.
- 산마늘 잎에서는 38종류의 유리아미노산이 분리되었다 (Table 4). 총 유리아미노산 함량은 535.39 mg/100 g이 었으며, 분리된 38종류의 유리 아미노산 중 asparagine, glutamic aicd 및 lysine이 각각 75.64, 42.05 및 30.32 mg/100 g을 나타내어 다른 유리아미노산에 비해 비교적 많이 함유되어 있었다. 함량이 20 mg/100g 이상 된 것에는 8종류가 있었으며, 10-19 mg/100 g 범위의 것에는 6종 류가 있었고, 나머지 18종류는 함량이 9 mg/100 g 이하를 나타냈다.
- 39 mg/100 g를 나타내었다. 총 페놀 함량은 메탄올 추출물(37.7 mg/L), 에탄올 추출물(31.9 mg/L), 열수 추출물(25.4 mg/L) 순으로 많게 나타났으며, 총 플라보노 이드 함량 또한 메탄올 추출물(22.2 mg/L), 에탄올 추출 물(21.1 mg/L), 열수 추출물(11.6 mg/L)순으로 많게 나타났다. 산마늘 잎 추출물 1000 mg/L의 DPPH 라디컬 소거능은 에탄올 추출물(51.
후속연구
- 0%의 억제 효과를 나타 냈다는 Park 등(2009)의 보고와 비교해 볼 때 항암효과가 매우 높음을 알 수 있었다. 따라서 본 연구 결과가 비록 기내 실험에 의한 것이지만 암세포 억제율이 높게 나타났기 때문에 산마늘을 식용하면 폐암과 위암의 예방과 치료에 다소나마 도움이 될 것으로 사료된다.
- 38 mm를 나타내었다. 이와 같이 조사된 자료는 산마늘의 이용시 기초 자료가 될 것이며, 산마늘의 섭취는 생리활성 효과를 높이고, 폐암과 위암의 예방과 치료에 다소나마 도움이 될 것으로 사료된다.
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