전통적인 방법으로 제조된 청국장으로부터 우수한 발효 균주들을 분리하여 재래식으로 청국장을 제조하고, 제조된 청국장의 생리활성 물질인 GABA를 유지 및 보강하면서 품질을 향상시키기 위하여 청국장 발효능이 뛰어난 종균을 찾아 분리하였다. 분리된 균주들 가운데 GABA의 함량이 높은 청국장을 생산하는 MC 31을 실험균주로 선택하였고 API Kit와 16S rDNA sequence를 통하여 Bacillus subtilis MC 31로 명명하였다. B. subtilis MC 31의 최적배지와 온도, 시간을 찾아본 결과 LB 배지에서 $37^{\circ}C$, 24시간이 가장 높은 생육을 나타내었다. GABA 생산에 적합한 발효 온도와 시간을 조절하여 최적 조건을 찾아본 결과 B. subtilis MC 31는 $40^{\circ}C$에서 72시간에 가장 많은 GABA를 생산하였다.
전통적인 방법으로 제조된 청국장으로부터 우수한 발효 균주들을 분리하여 재래식으로 청국장을 제조하고, 제조된 청국장의 생리활성 물질인 GABA를 유지 및 보강하면서 품질을 향상시키기 위하여 청국장 발효능이 뛰어난 종균을 찾아 분리하였다. 분리된 균주들 가운데 GABA의 함량이 높은 청국장을 생산하는 MC 31을 실험균주로 선택하였고 API Kit와 16S rDNA sequence를 통하여 Bacillus subtilis MC 31로 명명하였다. B. subtilis MC 31의 최적배지와 온도, 시간을 찾아본 결과 LB 배지에서 $37^{\circ}C$, 24시간이 가장 높은 생육을 나타내었다. GABA 생산에 적합한 발효 온도와 시간을 조절하여 최적 조건을 찾아본 결과 B. subtilis MC 31는 $40^{\circ}C$에서 72시간에 가장 많은 GABA를 생산하였다.
To isolate GABA-producing microorganisms, 1,500 strains were isolated from different Chungkookjang samples and screened. From these strains, 20 were selected for further analyses based on a protease and slime-producing activity test. The MC 31 strain showed the highest GABA concentration in Chungkoo...
To isolate GABA-producing microorganisms, 1,500 strains were isolated from different Chungkookjang samples and screened. From these strains, 20 were selected for further analyses based on a protease and slime-producing activity test. The MC 31 strain showed the highest GABA concentration in Chungkookjang and was used in this study. MC 31 was identified as Bacillus subtilis by an API 50CHB kit and 16S rDNA sequences analysis and named as B. subtilis MC 31. B. subtilis MC 31 showed exponential growth up to 12 hours at $37^{\circ}C$ in LB broth, and it reached a stationary phase after 24 to 36 hours of incubation. B. subtilis MC 31 showed maximum GABA content at 72 hours after incubation at $40^{\circ}C$.
To isolate GABA-producing microorganisms, 1,500 strains were isolated from different Chungkookjang samples and screened. From these strains, 20 were selected for further analyses based on a protease and slime-producing activity test. The MC 31 strain showed the highest GABA concentration in Chungkookjang and was used in this study. MC 31 was identified as Bacillus subtilis by an API 50CHB kit and 16S rDNA sequences analysis and named as B. subtilis MC 31. B. subtilis MC 31 showed exponential growth up to 12 hours at $37^{\circ}C$ in LB broth, and it reached a stationary phase after 24 to 36 hours of incubation. B. subtilis MC 31 showed maximum GABA content at 72 hours after incubation at $40^{\circ}C$.
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문제 정의
대두에 함유된 GABA와 같은 생리활성물질들을 증대시키기 위한 방법으로 다양한 연구가 발표되었으나 발효를 통해 증진시키는 미생물 관련 연구가 더욱 요구되고 있다. 따라서 본 연구는 대두를 청국장이나 된장으로 발효 시 GABA가 증가한다는 다양한 보고들을 바탕으로 청국장 발효능이 뛰어난 종균을 찾기 위해 여러 가지 청국장들로부터 발효 균주들을 분리하고, 분리된 균주들 가운데 GABA의 함량이 높은 청국장을 생산하는 실험균주를 선택하였다. 선택된 실험균주를 동정 하고, GABA의 대량 생산에 적합한 발효 온도와 시간을 살펴보았다.
B. subtilis MC 31로 부터 GABA대량 생산의 최적조건을 확립하기 위해 온도와 시간이 균의 GABA생산에 어떠한 영향을 미치는지 살펴보았다. B.
가설 설정
4). 이러한 결과를 바탕으로 최적배양 시간을 대수기에서 정지기로 들어가는 6시간으로 정하였다. Park [22] 등은 Bacillus sp.
따라서 본 연구는 대두를 청국장이나 된장으로 발효 시 GABA가 증가한다는 다양한 보고들을 바탕으로 청국장 발효능이 뛰어난 종균을 찾기 위해 여러 가지 청국장들로부터 발효 균주들을 분리하고, 분리된 균주들 가운데 GABA의 함량이 높은 청국장을 생산하는 실험균주를 선택하였다. 선택된 실험균주를 동정 하고, GABA의 대량 생산에 적합한 발효 온도와 시간을 살펴보았다.
5)에 도말하여 37℃에서 2일동안 배양하였다. 배양결과 skim milk배지 상에서 clear zone의 크기가 크고 선명하며, 성장속도가 빠른 colony만을 선별하여 청국장 발효실험에 사용하였다.
증자된 대두는 clean bench 안에서 45~50℃로 냉각한 후 LB broth에서 24시간 동안 종배양하고 6시간 동안 주 배양한 1차 선별균주를 2% 접종하여 40℃에서 72시간 동안 발효시켜 제조하였다. 균주들 가운데 청국장고유의 점질물을 형성하지 못하는 균주들을 실험 대상에서 제외하고, 점질물의 생성량이 많은 균주들을 후보균주들로 분리하여, 청국장 발효능과 각종활성을 측정하였다.
Protease활성을 측정하기 위해서 LB broth에 배양한 1차 선별균주를 15,000 rpm으로 15 min 동안 원심 분리한 뒤 상등액을 micro filter로 여과·제균 하여 조효소액으로 사용하였다. 멸균된 paper disc를 1% skim milk plate 위에 올려놓고, 조효소액 0.02 ml을 적점한 후 37℃에서 72시간 동안 반응시켜 생성된 clear zone을 측정하여 protease활성을 비교하였다.
점질물 생성능을 측정하기 위해 대두 15 g을 24시간 동안 초순수에 침지하여 충분히 불린 후 체로 걸러 물기를 제거한 뒤 발효용기에 넣고 호일로 감싸 autoclave로 121℃에서 50분간 증자하였다. 증자된 대두는 clean bench안에서 45~50℃로 냉각한 후 LB broth에서 24시간 동안 종배양하고 6시간 동안 주 배양한 1차 선별균주를 2% 접종하여 40℃에서 72시간 동안 발효시켜 청국장을 제조하였다.
점질물 생성능을 측정하기 위해 대두 15 g을 24시간 동안 초순수에 침지하여 충분히 불린 후 체로 걸러 물기를 제거한 뒤 발효용기에 넣고 호일로 감싸 autoclave로 121℃에서 50분간 증자하였다. 증자된 대두는 clean bench안에서 45~50℃로 냉각한 후 LB broth에서 24시간 동안 종배양하고 6시간 동안 주 배양한 1차 선별균주를 2% 접종하여 40℃에서 72시간 동안 발효시켜 청국장을 제조하였다. 완성된 청국장의 점질물이 늘어나는 길이와 굵기, 점질물의 양을 비교하여 점질물 생성능을 측정하였다.
증자된 대두는 clean bench안에서 45~50℃로 냉각한 후 LB broth에서 24시간 동안 종배양하고 6시간 동안 주 배양한 1차 선별균주를 2% 접종하여 40℃에서 72시간 동안 발효시켜 청국장을 제조하였다. 완성된 청국장의 점질물이 늘어나는 길이와 굵기, 점질물의 양을 비교하여 점질물 생성능을 측정하였다.
16 ml을 미리 넣어둔 microtube에 가하여 3~5분간 교반하였다. 그리고 이를 10,000 rpm에서 5분간 원심 분리한 후 syringe filter을 거쳐 나온 상징액 0.55 ml을 cuvette에 넣어 0.5 M K4P2O7용액 0.2 ml, 4 mM NADP용액 0.15 ml, 2.0 units Gabase/ml용액 0.05 ml를 각각 혼합하고 340 nm에서 흡광도(Optozen POP, Mecasys, Korea)를 측정(Initial A)하였다. 여기에 20 mM α-ketoglutarate용액 0.
분리균주들의 정확한 동정을 위하여 16S rRNA sequence비교·분석하였다.
용해시킨 용액을 0.45 μm membrane filter로 여과하여 아미노산 자동분석기(L-8800 Amino Acid Analyzer, Hitachi, Tokyo, Japan)를 이용하여 분석하였다.
실험균주의 탄소원 대사지문은 Biolog사의 MicroLogTM system (USA)을 이용하여 분리균주를 4시간 및 24시간 동안 배양한 후, 발색반응을 측정함으로써 조사하였다.
분리균주들의 정확한 동정을 위하여 16S rRNA sequence비교·분석하였다. 염기서열 분석을 통하여 얻어진 분리균주의 부분 염기서열은 Blast network service를 이용하여 GenBank에 등록된 다른 미생물의 염기서열과 비교함으로써 계통분류학적 유연관계를 분석하였다.
배양배지 종류에 따른 미생물의 생육을 측정하기 위해 실험 균주를 brain heart infusion (BHI)배지, luria-bertani media(LB) 배지, MRS배지, nutrient broth (NB) 배지에 접종하여 37℃에서 24시간 동안 150 rpm으로 진탕 배양 후 600 nm에서 흡광도(OD)를 측정하였다. 일반적으로 BHI배지는 dextrose broth와 뇌세포를 함유하고 있어 Streptococci의 생육에 최적배지로 쓰이고 LB는 Escherichia coli의 표준산업용 배지로 쓰이며, MRS배지는 sodium acetate가 포함되어 있어 Lactobacillales 의 생육에 경쟁적으로 작용하는 미생물을 약화시키는 특징을 지니고 NB는 주로 물, 하수, 배설물 등에서의 미생물을 분리하는데 이용되지만 위의 모든 배지들은 기본적으로 광범위하고 까다로운 미생물 생육에 사용이 가능하다.
일반적으로 BHI배지는 dextrose broth와 뇌세포를 함유하고 있어 Streptococci의 생육에 최적배지로 쓰이고 LB는 Escherichia coli의 표준산업용 배지로 쓰이며, MRS배지는 sodium acetate가 포함되어 있어 Lactobacillales 의 생육에 경쟁적으로 작용하는 미생물을 약화시키는 특징을 지니고 NB는 주로 물, 하수, 배설물 등에서의 미생물을 분리하는데 이용되지만 위의 모든 배지들은 기본적으로 광범위하고 까다로운 미생물 생육에 사용이 가능하다. 배지온도에 따른 미생물의 생장을 측정하기 위해 실험균주를 앞의 결과에 선택된 최적배지에 접종하여 30℃, 35℃, 37℃, 40℃, 45℃, 50℃에서 24시간 동안 150 rpm으로 진탕 배양 후 600 nm에서 흡광도를 측정하였다. 배지시간에 따른 미생물의 생장을 측정하기 위해 실험균주를 앞의 결과에 선택된 최적배지와 온도에서 150 rpm으로 진탕 배양하면서 3시간 간격으로 600 nm에서 흡광도를 측정하였다.
배지온도에 따른 미생물의 생장을 측정하기 위해 실험균주를 앞의 결과에 선택된 최적배지에 접종하여 30℃, 35℃, 37℃, 40℃, 45℃, 50℃에서 24시간 동안 150 rpm으로 진탕 배양 후 600 nm에서 흡광도를 측정하였다. 배지시간에 따른 미생물의 생장을 측정하기 위해 실험균주를 앞의 결과에 선택된 최적배지와 온도에서 150 rpm으로 진탕 배양하면서 3시간 간격으로 600 nm에서 흡광도를 측정하였다.
B. subtilis MC 31에 의해 발효가 된 청국장의 정확한 GABA 함량을 조사하기 위해 최적 생육조건과 발효조건을 바탕으로 아미노산 분석을 하였다. 시료 0.
대두를 원료로 하여 청국장을 제조 시 단백질은 발효과정을 통해 Bacillus subtilis가 분비하는 protease의 작용으로 polypeptide가 peptide와 amino acid로 분해되어 소화흡수 되기 쉽도록 분해되고 끈적끈적한 점질물이 생성되어 고유의 맛과 향을 지니게 된다[6]. Protease활성과 점질물 생성능을 측정하여 청국장 발효 능력을 평가할 수 있으므로 1차 선별된 200여 종의 균주에서 protease활성과 점질물 생성능을 측정하였다(Table 1). 측정 결과 점질물 형성능력이 양호한 동시에 protease활성을 나타내는 20개의 균주를 2차 선별하였다.
Strain No. MC31의 동정을 위한 기초 실험으로 gram염색과 catalase test를 실시하였다. 그 결과 strain No.
B. subtilis MC 31의 최적 온도를 알아보기 위하여 앞의 결과에 선택된 최적배지인 LB액체배지에 접종하여 30℃, 35℃, 37℃, 40℃, 45℃, 50℃에서 24시간 동안 배양 후 흡광도를 측정하였다. 그 결과 30℃에서 40℃까지 비교적 넒은 범위에서 생육이 높게 나타났으며 그 중 37℃에서 가장 높은 생육을 보여 B.
5). 이러한 결과를 바탕으로 GABA가 가장 많이 생성되는 청국장 최적 발효 온도를 40℃로 정하였다. B.
52 μg/ml까지 지속적으로 증가하다 72시간 이후로는 큰 차이 없이 일정하였다. B. subtilis MC 31을 이용하여 청국장을 제조 시 GABA함량이 70시간에서 최대인 것으로 보아 최적시간을 70시간으로 정하였다. 선실험인 B.
대상 데이터
청국장 제조에 사용된 대두는 2011년 국내에서 수확된 국산대두를 구입하여 사용하였으며, 청국장 발효 균주를 분리하기 위해 가정, 대중음식점 그리고 기존 제품으로 판매되고 있는 청국장 등을 시료로 수집하여 사용하였다. 미생물 배양용 배지로는 luria-bertani media (LB)를 사용하였으며 균주의 단백질 분해능을 조사하기 위한 배지로는 1% skim milk를 포함하는 표준한천배지를 사용하였고 구성시약은 Difco Lab.
(Detroit, MI, USA)사의 제품을 사용하였다. GABA함량 측정에 필요한 시약들은 Sigma Co. (St. Louis, MO, USA), Junsei Co. (Tokyo, Japan), 그리고 Yakuri Co. (Kyoto, Japan)의 제품을 구입하여 사용하였다.
시판되는 청국장으로부터 발효에 관여하는 것으로 보이는 1,500여 종의 균을 분리하고, 단일 균주를 이용한 청국장 발효 실험에 사용하였다. 제조된 1,500여 개의 청국장을 육안으로 점질물 함량을 비교하고 점질물 함량이 많은 200여 종의 균주를 1차 선별하였다.
시판되는 청국장으로부터 발효에 관여하는 것으로 보이는 1,500여 종의 균을 분리하고, 단일 균주를 이용한 청국장 발효 실험에 사용하였다. 제조된 1,500여 개의 청국장을 육안으로 점질물 함량을 비교하고 점질물 함량이 많은 200여 종의 균주를 1차 선별하였다.
Protease활성과 점질물 생성능을 측정하여 청국장 발효 능력을 평가할 수 있으므로 1차 선별된 200여 종의 균주에서 protease활성과 점질물 생성능을 측정하였다(Table 1). 측정 결과 점질물 형성능력이 양호한 동시에 protease활성을 나타내는 20개의 균주를 2차 선별하였다. 그 중에서도 특히 strain No.
따라서 GABA함량측정결과 분리된 균주 가운데 가장 함량이 높은 strain No. MC 31을 실험균주로 선택하였다.
subtilis MC 31의 최적 생장배지를 알아보기 위하여 BHI, LB, MRS, NB배지에 접종하여 37℃에서 24시간 동안 배양 후 흡광도를 측정한 결과 NB배지를 제외한 모든 배지에서 비교적 양호한 생육을 나타내었다. 특히 LB에서 가장 높은 생육을 보였으며, LB에 비해 BHI에서 93%, MRS에서 83%, NB에서 35% 의 낮은 생육을 보여 LB를 최적 배지로 실험에 사용하였다(Fig. 2).
이론/모형
GABA함량을 측정하기 위해서 청국장의 GABA정량은 Zhang과 Bown의 방법을 사용하였다[29]. 시료의 전처리를 위해 48시간 동결 후 동결진공 건조하여 분말화한 뒤 불순물과 시료의 색소 등을 제거하기 위해 청국장 분말 0.
subtilis MC 31 isolated from Chungkookjang. The branching pattern was generated by the neighbor-joining method. Bar, 0.
성능/효과
MC 31의 16S rRNA sequence를 비교·분석한결과 Bacillus subtilis strain GD3b와 99%의 상동성으로 biolog system에 의한 동정과 일치하는 결과를 보여 Bacillus subtilis MC 31로 명명하였다(Fig. 1).
MS 268, MC31, MC40은 protease활성과 점질물 형성이 +++ 이상으로 우수하였다. 실험을 통해 protease의 투명환과 점질물이 늘어나는 길이에 비례하여 활성도 높아지는 것을 확인하였다.
B. subtilis MC 31의 최적 생장배지를 알아보기 위하여 BHI, LB, MRS, NB배지에 접종하여 37℃에서 24시간 동안 배양 후 흡광도를 측정한 결과 NB배지를 제외한 모든 배지에서 비교적 양호한 생육을 나타내었다. 특히 LB에서 가장 높은 생육을 보였으며, LB에 비해 BHI에서 93%, MRS에서 83%, NB에서 35% 의 낮은 생육을 보여 LB를 최적 배지로 실험에 사용하였다(Fig.
subtilis MC 31의 최적 온도를 알아보기 위하여 앞의 결과에 선택된 최적배지인 LB액체배지에 접종하여 30℃, 35℃, 37℃, 40℃, 45℃, 50℃에서 24시간 동안 배양 후 흡광도를 측정하였다. 그 결과 30℃에서 40℃까지 비교적 넒은 범위에서 생육이 높게 나타났으며 그 중 37℃에서 가장 높은 생육을 보여 B. subtilis MC 31의 최적 배양 온도는 37℃임을 확인하였다(Fig. 3). Xiao [28]은 분리한 B.
B. subtilis MC 31의 생장 곡선을 알아보기 위하여 앞의 결과에 선택된 최적배지와 온도인 LB액체배지에 접종하여 37℃에서 진탕 배양하여 3시간 간격으로 흡광도를 측정한 결과 0-6시간 까지 대수기를 나타내었고, 6시간 이후 18시간까지 증식이 점차 느려져 18시간에서 36시간까지 정지기에 들어갔다(Fig. 4). 이러한 결과를 바탕으로 최적배양 시간을 대수기에서 정지기로 들어가는 6시간으로 정하였다.
B. subtillis MC 31을 대두에 접종하여 배양 온도 별로 72시간 배양 후 GABA함량을 측정한 결과 40℃에서 1.524 μg/ml로 가장 높은 GABA함량을 보였고 그 다음으로 45℃에서 1.475 μg/ml, 35℃에서 1.425 μg/ml, 30℃에서 1.375 μg/ml, 50℃에서 1.276 μg/ml 순으로 낮아졌다(Fig. 5).
GABA함량을 측정한 결과 B. subtiliMC 31은 증자하기 전의 원료대두의 GABA함량에 비해 증자 후 감소하여 값이 1.14 μg/ml 이였으나 발효가 진행됨에 따라 12시간에 1.18 μg/ml, 36시간에 1.43 μg/ml, 48시간에 1.47 μg/ ml, 60시간에 1.52 μg/ml까지 지속적으로 증가하다 72시간 이후로는 큰 차이 없이 일정하였다.
subtilis MC 31을 이용하여 청국장을 제조 시 GABA함량이 70시간에서 최대인 것으로 보아 최적시간을 70시간으로 정하였다. 선실험인 B. subtilis MC 31의 생육곡선 결과와 최적 발효배양조건을 비교해보면 생육은 6시간 만에 대수기에서 정지기로 들어가는 빠른 생육을 보인데 반해 청국장으로 제조 시 GABA함량은 36시간부터 일정해지는 결과를 보여 GABA생산속도가 균의 생육속도에 비해 떨어지며 생육에 상관없이 그 이후로도 계속해서 GABA는 생산되는 것으로 판단된다. Eom [3]은 원료 콩의 증자 후 GABA함량은 증자전보다 감소하였으나 발효가 진행됨에 따라 증가하여 발효 72시간에는 약 5.
B. subtilis MC 31의 최적 생육조건과 발효조건을 바탕으로 청국장을 제조하여 GABA함량을 조사한 결과 일반적으로 알려진 삶은 콩 함량인 0.025 mg/g보다 발효가 진행되면서 0.2 mg/g까지 증가하였다(data not shown). Jo [7]는 전통된장의 숙성기간에 따른 GABA함량이 숙성기간 1년 경과된 된장의 경우 0.
이상의 결과로 미루어 보아 B. subtilis MC 31은 높은 peotease활성과 점질물 생성능을 보이고 청국장으로 제조 시 뛰어난 GABA생성능이 있어 우수한 청국장 제조용 균주로 사용이 가능한 것으로 사료된다.
질의응답
핵심어
질문
논문에서 추출한 답변
낫토와 비교했을 때 우리나라 청국장의 특징은 무엇입니까?
다른 나라에서도 대두를 이용하여 그 나라의 기호에 맞는 발효식품들이 발전하였는데, 그 예로 중국의 간장, 된장 및 청국장과 일본의 natto, 인도네시아의 tempeh을 들 수 있다[8]. 우리나라의 청국장은 일본의 natto에 비해 원료의 차이는 없지만 발효과정 중 대두의 종류도 다양하게 쓸 수 있고 단일 균이 아닌 다양한 미생물이 관여하여 세균 주도형 발효패턴을 취하고 있는 것이 특징이다[27]. 우리 나라 전통대두발효식품인 청국장은 단백질과 불포화지방산의 함량이 많고 소화율이 높은 고단백식품[19]으로 다른 전통장에 비해 담그는 기간이 짧고 방법이 간단하다.
다른 나라의 대두 발효 식품은 무엇이 있습니까?
그러나 콩은 조직이 단단하여 그대로 삶거나 볶아서 섭취하기에는 소화흡수가 잘 되지 않기 때문에 대두를 가공하거나 발효시켜 소화율과 영양가를 높여서 섭취하기 위한 식품들이 개발되었고, 청국장은 대두를 짧은 기간에 발효시키는 식품으로 한국의 뚜렷한 사계절 기후에 맞는 독특한 조리법으로 발달되어 왔다[12]. 다른 나라에서도 대두를 이용하여 그 나라의 기호에 맞는 발효식품들이 발전하였는데, 그 예로 중국의 간장, 된장 및 청국장과 일본의 natto, 인도네시아의 tempeh을 들 수 있다[8]. 우리나라의 청국장은 일본의 natto에 비해 원료의 차이는 없지만 발효과정 중 대두의 종류도 다양하게 쓸 수 있고 단일 균이 아닌 다양한 미생물이 관여하여 세균 주도형 발효패턴을 취하고 있는 것이 특징이다[27].
우리나라의 청국장의 제조 방법은?
우리 나라 전통대두발효식품인 청국장은 단백질과 불포화지방산의 함량이 많고 소화율이 높은 고단백식품[19]으로 다른 전통장에 비해 담그는 기간이 짧고 방법이 간단하다. 전통적인 청국장은 대두를 18시간 이상 불려서 익힌 다음 볏짚에 있는 Bacillus subtilis를 이용하여 40℃에서 2~3일 정도 발효를 시켜 만든다[20]. 청국장은 발효가 진행됨에 따라 숙성 과정 중 균으로부터 각종 효소가 생성이 되고 그 효소들이 청국장에 작용하여 대두 성분들을 분해해 소화를 증진시키고 발효과정 중 특이한 향미와 구수한 맛을 형성하는 동시에 끈끈한 점질물을 생성시킨다[25].
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