[논문]Bacillus subtilis에 의한 발아 및 미발아 황태 청국장 발효

이나리; 고태훈; 박성보; 이상미; 황대연; 김동섭; 박근태; 손홍주

doi:10.4014/kjmb.1211.11006

[국내논문] Bacillus subtilis에 의한 발아 및 미발아 황태 청국장 발효
Fermentation of Germinated- and Nongerminated-Yellow Soybean Chungkookjang Using Bacillus subtilis 원문보기

한국미생물·생명공학회지 = Korean journal of microbiology and biotechnology, v.41 no.2, 2013년, pp.160 - 167

이나리 (부산대학교 생명자원과학대학) , 고태훈 (부산대학교 생명자원과학대학) , 박성보 (부산대학교 생명자원과학대학) , 이상미 (부산대학교 생명자원과학대학) , 황대연 (부산대학교 생명자원과학대학) , 김동섭 (부산대학교 생명자원과학대학) , 박근태 (부산대학교 산학협력단) , 손홍주 (부산대학교 생명자원과학대학)

Abstract ▼ AI-Helper

In order to investigate changes in quality and enzyme activity during Chungkookjang fermentation, germinated- and nongerminated yellow soybeans were fermented by Bacillus subtilis and traditional methods. When the soybean was soaked for 6 h and then watered for 4 days with 2 h-interval at $25^{\circ}C$, the highest germination rate was obtained. The germinated soybeans had a higher total isoflavone ($988.4{\mu}g/g$) than that of the nongerminated soybeans ($859.5{\mu}g/g$). Amino type nitrogen contents, protease and amylase activities were higher in germinated soybean Chungkookjang, which was fermented with B. subtilis, than nongerminated soybean Chungkookjang, which was fermented with B. subtilis and traditional methods. Reducing sugar and amino type nitrogen contents, the number of viable cells and protease and amylase activities, were higher for Chungkookjang fermented with B. subtilis, than Chungkookjang fermented by traditional methods. ALP and SOD activities in the Chungkookjang diet group were considerably higher than in the control group. AST activity in the germinated soybean Chungkookjang diet group was higher than in the nongerminated soybean Chungkookjang diet group. In conclusion, it is suggested that Chungkookjang prepared with germinated soybeans using B. subtilis D7 could be practically used as a functional product.

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제안 방법

본 연구에서는 시판되고 있는 대부분의 청국장이 볏짚을 이용하여 제조되고 있기 때문에 품질의 일관성 없다는 사실과 발아시킨 콩에는 이전에 존재하던 성분이 대폭 강화된다는 사실에 착안하여 콩의 발아조건 및 기능성 성분 분석, 순수분리된 발효균주를 이용한 청국장 발효조건을 확립하였다. 또한 청국장이 간세포에 미치는 영향을 실험동물을 이용하여 조사함으로써 인체에 유익한 효능을 간접적으로 확인하였다.
본 연구에서는 시판되고 있는 대부분의 청국장이 볏짚을 이용하여 제조되고 있기 때문에 품질의 일관성 없다는 사실과 발아시킨 콩에는 이전에 존재하던 성분이 대폭 강화된다는 사실에 착안하여 콩의 발아조건 및 기능성 성분 분석, 순수분리된 발효균주를 이용한 청국장 발효조건을 확립하였다. 또한 청국장이 간세포에 미치는 영향을 실험동물을 이용하여 조사함으로써 인체에 유익한 효능을 간접적으로 확인하였다.
콩의 isoflavone (Sigma, USA) 함량은 HPLC (PerkinElmer, USA)를 사용하여 다음과 같이 분석하였다[29]. 분쇄한 시료 1 g에 0.
이동상은 시작 시 20% methanol 100에서 50분 후 60% methanol 100이 되도록 하였고, 유속은 1 ml/분이었다. Isoflavone 함량은 표준물질의 농도에 대한 피크의 면적을 표준정량곡선으로부터 계산하였다.
청국장과 증류수를 1 : 6 (w/v)의 비율로 혼합하여 분쇄하였다. 원심분리한 후, 상등액을 회수하여 각종 발효변수 분석에 사용하였다. 대조구로는 미발아콩에 B.
05% KI] 용액 10 ml을 첨가하였다. 600 nm에서 흡광도를 UV/VIS spectrophotometer (Pharmacia Biotech, England)를 이용하여 측정하였다. 효소 1 unit는 상기 조건에서 blank 흡광도가 10% 감소되는 효소량으로 정의하였다.
동결건조된 청국장 20 g을 증류수 200 ml에 첨가하여 진탕(200 rpm, 20분)한 후, 원심분리(580 ×g, 20분)로 잔여물을 제거하고, 상등액을 회수하여 다시 동결건조함으로써 청국장 추출물을 조제하였다.
ICR 마우스는 방사선 조사된 사료(Purina Mills Inc, Korea)를 자유 급식하였으며, 12시간의 조명주기(08:00~20:00)로 specified pathogen-free 상태인 부산대학교 청정실험동물센터(온도 23 ± 2℃, 상대습도 50 ± 5%)에서 사육하였다. ICR 마우스를 4개 군으로 분류하여 군당 5마리의 실험동물을 임의적으로 배정하였으며, 증류수 음용군(대조군), B. subtilis D7-발아콩 청국장 음용군, B. subtilis D7-미발아콩 청국장 음용군, 볏짚-미발아 콩 청국장 음용군으로 구분하여 실험하였다. 이때 청국장 시료는 다음과 같이 조제하였다.
동결건조된 청국장 20 g을 증류수 200 ml에 첨가하여 진탕(200 rpm, 20분)한 후, 원심분리(580 ×g, 20분)로 잔여물을 제거하고, 상등액을 회수하여 다시 동결건조함으로써 청국장 추출물을 조제하였다. 최종적으로 얻어진 추출물을 증류수에 70 mg/ml의 농도로 희석하여 존데를 통하여 1일 1회 투여하였다. 7일 후에 CO₂ 가스를 이용하여 마우스를 안락사시킨 후, 부검을 실시하였다.
최종적으로 얻어진 추출물을 증류수에 70 mg/ml의 농도로 희석하여 존데를 통하여 1일 1회 투여하였다. 7일 후에 CO₂ 가스를 이용하여 마우스를 안락사시킨 후, 부검을 실시하였다.
청국장 섭취가 혈청 내 유전자의 발현에 미치는 영향을 최소화하기 위하여 24시간 동안 절식하여 CO₂ 가스를 이용하여 마우스를 안락사시킨 후, 혈액을 채취하였다. 혈액을 실온에서 30분 동안 방치한 후, 원심분리하여 혈청을 수거하였으며, 혈청 내 효소의 변화는 혈청분석기(HITACHI 7080 Automatic Analyzer, Japan)를 이용하여 ALP (alkaline phosphatase)는 Tietze 방법[28], AST (asparatate aminotransferase) 및 ALT (alanine aminotransferase)는 Reitman과 Frankel의 방법[23]으로 분석하였다.
당류는 청국장 발효과정 중에 원료콩의 전분질이 Bacillus 등의 미생물이 생산한 효소의 작용으로 분해되어 생성되며, 청국장 감미의 주성분이다. 콩에 있는 전분이 glucose로 전환되는 양을 조사하기 위하여 발효 경과에 따른 환원당의 양을 측정하였고, 그 결과는 Fig. 1에서 보는 바와 같다. B.

대상 데이터

사용된 컬럼은 μ-Bondapak C18 컬럼(Agilent Technologies, USA)이었고, UV detector를 이용하여 254 nm에서 분석하였다.
본 실험에서 청국장 발효를 위하여 사용된 균주는 Lee 등[18]에 의하여 한국의 전통식품인 된장으로부터 분리, 동정된 Bacillus subtilis D7이었으며, 콩은 재배농가에서 직접 구입한 노랑콩(황태, Glycine max L. Merr)이었다.
원심분리한 후, 상등액을 회수하여 각종 발효변수 분석에 사용하였다. 대조구로는 미발아콩에 B. subtilis D7을 접종한 것과 미발아콩에 볏짚 끓인 물(100℃, 20분)을 접종한 것을 사용하였다.
ICR 마우스는 방사선 조사된 사료(Purina Mills Inc, Korea)를 자유 급식하였으며, 12시간의 조명주기(08:00~20:00)로 specified pathogen-free 상태인 부산대학교 청정실험동물센터(온도 23 ± 2℃, 상대습도 50 ± 5%)에서 사육하였다.
본 연구는 부산대학교 동물실험윤리위원회(PNU-IACAU)로부터 과학성과 윤리성에 대한 심사를 거쳐 승인을 받아 수행되었다. 식이실험에 사용된 동물은 8주령의 ICR 마우스이며, 샘타코(Korea)로부터 구입하였다. ICR 마우스는 방사선 조사된 사료(Purina Mills Inc, Korea)를 자유 급식하였으며, 12시간의 조명주기(08:00~20:00)로 specified pathogen-free 상태인 부산대학교 청정실험동물센터(온도 23 ± 2℃, 상대습도 50 ± 5%)에서 사육하였다.

데이터처리

실험결과는 mean ± SD로 제시하였으며, 평균값간의 유의 성은 SPSS (Statistical Package Inc., USA) version 18을 이용하여 one-way ANOVA 분석(Turkey method)을 실시하여 검증하였다(p < 0.05).

이론/모형

생균수는 청국장 1 g을 멸균수 9 ml에 첨가하여 계단희석한 후, 표준평판법에 의하여 배양하여 계수하였다. 환원당은 dinitrosalicylic acid (DNS; Sigma, USA) method [20]을 사용하여 정량하였다.
생균수는 청국장 1 g을 멸균수 9 ml에 첨가하여 계단희석한 후, 표준평판법에 의하여 배양하여 계수하였다. 환원당은 dinitrosalicylic acid (DNS; Sigma, USA) method [20]을 사용하여 정량하였다.
아미노태 질소는 Formol 적정법[1]으로 측정한 후, 다음 식에 의하여 산출하였다.
암모니아태 질소는 Indophenol blue method [1]에 의하여측정하였으며, NH₄Cl을 표준물질로 사용하여 Indophenol법으로 작성된 표준곡선으로부터 환산하였다.
간세포 내 superoxide dismutase (SOD) 활성은 microplate WST-1 assay를 이용하여 조사하였다[33]. 실험동물에서 적출한 간 100 mg을 sucrose buffer 600 μl에 넣고 homogenizer를 이용하여 마쇄하였다.
가스를 이용하여 마우스를 안락사시킨 후, 혈액을 채취하였다. 혈액을 실온에서 30분 동안 방치한 후, 원심분리하여 혈청을 수거하였으며, 혈청 내 효소의 변화는 혈청분석기(HITACHI 7080 Automatic Analyzer, Japan)를 이용하여 ALP (alkaline phosphatase)는 Tietze 방법[28], AST (asparatate aminotransferase) 및 ALT (alanine aminotransferase)는 Reitman과 Frankel의 방법[23]으로 분석하였다.

성능/효과

콩의 발아 전후 isoflavone 함량을 조사한 결과, 발아 전(859.5 μg/g)보다 발아 후(988.4 μg/g)의 총 isoflavone 함량이 높았다(Table 2).
콩을 1-7시간동안 증류수에 수침시킨 후 2-6시간마다 물을 공급하여 조사한 결과, 6시간 침지 및 2시간마다 4일 동안 물을 공급했을 때 발아율이 가장 높았다(Table 1). 이 조건에서 온도에 따른 발아율을 검토한 결과, 25℃에서 발아율이 72%로 가장 높았지만 통계학적으로 20℃와 25℃ 사이에는 유의성은 없었다.
콩을 1-7시간동안 증류수에 수침시킨 후 2-6시간마다 물을 공급하여 조사한 결과, 6시간 침지 및 2시간마다 4일 동안 물을 공급했을 때 발아율이 가장 높았다(Table 1). 이 조건에서 온도에 따른 발아율을 검토한 결과, 25℃에서 발아율이 72%로 가장 높았지만 통계학적으로 20℃와 25℃ 사이에는 유의성은 없었다. 이상의 결과로 콩의 발아는 20-25℃에서 유도하는 것이 가장 좋을 것으로 판단되지만 10℃, 18℃, 25℃ 및 35℃에서 각각 2% 미만, 95%, 75% 및 68%의 발아율을 나타내었고, 25℃보다 18℃에서 높은 발아율을 보였다는 Park 등[22]의 보고와는 상이하였다.
5 mg/g으로 증가하였다가 그 이후 감소하였다. 볏짚을 접종한 경우, B. subtilis D7을 접종한 것에 비해 낮은 환원당 함량을 나타내었으며, 일정한 패턴이 나타나지 않았고, 반복적인 증감현상이 있었다. 이와 같이 모든 청국장에서 발효 24시간 내에 환원당 함량이 급증하는 이유는 미생물의 생육에 따른 amylase의 작용에 의한 것으로 보이며[21], 특히 환원당 함량 변화 패턴과 β-amylase 활성의 변화 패턴(다음에 제시)이 유사한 것으로 보아 상관관계가 있는 것으로 판단된다.
현재 우리나라의 식품공전에는 청국장의 아미노태 질소의 함량을 280 mg%/g 이상으로 규정하고 있다. Fig. 2에서 보는 바와 같이 모든 실험구에서 발효시간 경과에 대체로 비례하여 아미노태 질소의 함량이 증가하였고, 발효 24시간 이후에 급격하게 증가하였다. 발효 48시간에 B.
2에서 보는 바와 같이 모든 실험구에서 발효시간 경과에 대체로 비례하여 아미노태 질소의 함량이 증가하였고, 발효 24시간 이후에 급격하게 증가하였다. 발효 48시간에 B. subtilis D7-발아콩, B. subtilis D7-미발아콩, 볏짚-미발아콩의 아미노태 함량은 각각 345 mg%/g, 238 mg%/g, 208 mg%/g를 나타내었다. 발아콩을 이용한 경우와 미발아콩을 이용한 경우의 생성 패턴은 비슷하였으나 발아콩을 이용했을 때 함량이 높았다.
subtilis D7-미발아콩, 볏짚-미발아콩의 아미노태 함량은 각각 345 mg%/g, 238 mg%/g, 208 mg%/g를 나타내었다. 발아콩을 이용한 경우와 미발아콩을 이용한 경우의 생성 패턴은 비슷하였으나 발아콩을 이용했을 때 함량이 높았다. 볏짚을 이용한 경우는 B.
미발아콩을 이용한 경우 발효 48시간에 221 mg%/g을 나타내었다. 발아콩을 이용한 경우는 미발아콩을 이용한 경우보다 암모니아태 질소의 생성이 월등히 높았다. 볏짚을 접종한 경우, 5-124.
4에서 보는 바와 같이 청국장 발효 초기에는 중성 영역을 나타내다가 발효시간 경과에 따라 알칼리영역으로 전환되었다. 모든 실험구에 있어 pH는 6.7-7.9의 범위를 나타내어 발효에 따른 큰 차이는 보이지 않았으며, pH가 알칼리로 이동하는 것은 콩 단백질 분해에 기인한 것으로 판단된다. 청국장 발효과정 중의 pH 변화에 관한 보고는 상당히 많은 편으로 Jeong 등[6]은 청국장의 초기 pH 6.
68의 범위를 나타내어 알칼리영역으로 전환되는 것으로 나타났으며 그 원인은 발효시 생성되는 암모니아 등의 가스 때문인 것으로 보고하였다. 본 실험 결과 또한 pH와 암모니아태 질소의 생성 패턴이 유사한 것으로 나타났다.
청국장에서의 생균수를 측정한 결과는 Fig. 5에서 보는 바와 같이 발효시간이 경과하면서 생균수는 증가함을 알 수 있었다. B.
subtilis D7-미발아콩의 경우, 발효 6시간에 24 U/g에서 18시간에 49 U/g로 증가한 후, 일정하게 유지되었다. 전체적으로 일정한 패턴을 나타내었으며, 발아콩을 이용한 경우 높은 활성을 나타내었다. 볏짚-미발아콩 경우 16-44 U/g의 범위에 있었고, B.
Superoxide dismutase (SOD)는 체내의 과잉 활성산화물을 제거해주는 효소로서 매우 중요하다. 먼저 청국장 추출물이 마우스 간세포의 SOD 활성에 미치는 영향을 조사한 결과, Table 3에서 보는 바와 같이 B. subtilis D7-발아콩의 경우 94%, B. subtilis D7-미발아콩의 경우 95%, 볏짚-미발아콩의 경우 94%로 실험한 모든 청국장이 대조군인 증류수(71%)에 비하여 높은 항산화 활성을 나타내었다. 청국장 자체의 SOD 활성에 대한 연구는 일부 이루어져 있지만 청국장이 마우스 간세포의 SOD 활성에 미치는 영향은 거의 조사되어 있지 않다.
특히 혈액 내 이러한 효소의 증가는 간세포의 necrosis나 질병을 나타내는 중요한 지표이다. 따라서 청국장이 마우스의 간세포에 미치는 영향을 분석하기 위해 먼저 혈청에서 ALP 활성을 측정한 결과, B. subtilis D7-발아콩, B. subtilis D7-미발아콩, 볏짚-미발아콩은 각각 68%, 73%, 79%로서 대조군(92%)에 비해 ALP의 활성을 감소시킬수 있었는데 특히, B. subtilis D7-발아콩은 ALP 활성 감소 효과가 우수하였다(Table 3). 이러한 결과는 청국장이 ALP 감소를 통한 간세포 보호에 매우 우수한 효과가 있음을 나타내는 것이다.
subtilis D7-발아콩에서만 관찰되었고, 그 외 청국장에서는 AST 감소 효과가 거의 관찰되지 않았다. 또한 실험한 모든 청국장은 ALT 활성 감소에 별다른 영향을 미치지 않았다. 볏짚-미발아콩의경우 ALT 활성을 약간 증가시켰으나 결과의 유의성은 없었다.
요약하면, 콩은 6시간 침지 및 2시간마다 4일 동안 물 공급 및 25℃에서 발아율이 가장 높았다. Isoflavone 함량은 발아 전보다 발아 후에 높게 나타났다.
subtilis D7과 볏짚물-비발아콩을 이용한 경우보다 높게 나타났다. 종균을 이용해 발효된 청국장의 경우 환원당 함량, 아미노태 질소 함량, 생균수, protease 활성 및 amylase 활성 등에서 볏짚을 이용한 경우에 비해 더 높게 나타났다. 동물실험을 통한 생산된 청국장의 유효성을 검증한 결과, 모든 청국장은 간세포의 SOD 활성과 혈청 ALP 활성을 증가시켰으며, 발아콩을 이용한 경우에서만 혈청 AST 활성이 증가되었다.
종균을 이용해 발효된 청국장의 경우 환원당 함량, 아미노태 질소 함량, 생균수, protease 활성 및 amylase 활성 등에서 볏짚을 이용한 경우에 비해 더 높게 나타났다. 동물실험을 통한 생산된 청국장의 유효성을 검증한 결과, 모든 청국장은 간세포의 SOD 활성과 혈청 ALP 활성을 증가시켰으며, 발아콩을 이용한 경우에서만 혈청 AST 활성이 증가되었다. 따라서 종균을 이용해 발효된 청국장(특히, 발아콩을 이용한 경우)은 볏짚을 이용해 발효된 청국장에 비해 여러 가지 화학성분이 우수한 것으로 나타나 기능성 성분의 증가와 더불어 품질 향상을 기대할 수 있을 것으로 판단된다.
동물실험을 통한 생산된 청국장의 유효성을 검증한 결과, 모든 청국장은 간세포의 SOD 활성과 혈청 ALP 활성을 증가시켰으며, 발아콩을 이용한 경우에서만 혈청 AST 활성이 증가되었다. 따라서 종균을 이용해 발효된 청국장(특히, 발아콩을 이용한 경우)은 볏짚을 이용해 발효된 청국장에 비해 여러 가지 화학성분이 우수한 것으로 나타나 기능성 성분의 증가와 더불어 품질 향상을 기대할 수 있을 것으로 판단된다.
6 log CFU/g의 범위에 있었다. 전체적으로 발효시간 경과에 따라 생균수는 증가하였으며, B. subtilis D7을 이용한 경우가 볏짚을 이용한 경우보다 높은 생균수를 나타내었다. Cho 등[2]은 B.

후속연구

콩을 발효시키면 대부분의 isoflavone은 비배당체로 전환되어 콜레스테롤 수치를 감소시키는 등 생리활성이 증가되는 것으로 보고되어 있다[11]. Isoflavone은 체내 이용률이 낮은 배당체인 genistin, daiszin, glycitin 등과 체내 이용률이 높은 비배당체인 genistein, daidzein, glycitein 등의 형태로 존재하므로 향후 청국장 발효에 따른 비배당체 함량 변화를 보다 구체적으로 조사할 필요가 있음을 알 수 있었다.
아미노태 질소 함량의 증가는 단백질이 분해되어 아미노산이 생성된다는 것을 의미한다. 따라서 조미 성분인 아미노산의 증가로 인하여 관능검사를 하지 않아도 청국장의 감칠맛이 뛰어날 것으로 사료되지만 추후 관능검사를 해 볼 필요가 있음을 알 수 있었다.
현재 암모니아태 질소에 의한 불쾌취가 청국장 소비의 제한요인으로 작용하여 청국장의 소비량이 감소되는 주요 원인이 되고 있다. 향후 불쾌취를 제거하여 청국장을 제조하는 부분에 대해서 연구할 필요가 있다고 사료된다. Youn 등[32]은 B.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	아미노태 질소는 무엇입니까?	청국장이 가지는 구수한 맛의 척도인 아미노태 질소는 청국장 발효숙성 중 단백질이 분해되어 생성되는 물질로서, 장류 발효의 중요한 품질 지표이다. 현재 우리나라의 식품공전에는 청국장의 아미노태 질소의 함량을 280 mg%/g 이상으로 규정하고 있다.
	한국의 식품 공정에서 규정하고 있는 청국장의 아미노태 질소의 함량은?	청국장이 가지는 구수한 맛의 척도인 아미노태 질소는 청국장 발효숙성 중 단백질이 분해되어 생성되는 물질로서, 장류 발효의 중요한 품질 지표이다. 현재 우리나라의 식품공전에는 청국장의 아미노태 질소의 함량을 280 mg%/g 이상으로 규정하고 있다. Fig.
	콩의 isoflavone은 어떤 형태로 존재합니까?	콩을 발효시키면 대부분의 isoflavone은 비배당체로 전환되어 콜레스테롤 수치를 감소시키는 등 생리활성이 증가되는 것으로 보고되어 있다[11]. Isoflavone은 체내 이용률이 낮은 배당체인 genistin, daiszin, glycitin 등과 체내 이용률이 높은 비배당체인 genistein, daidzein, glycitein 등의 형태로 존재하므로 향후 청국장 발효에 따른 비배당체 함량 변화를 보다 구체적으로 조사할 필요가 있음을 알 수 있었다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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