[논문]SK-N-SH 신경세포내 항산화 효과와 p38 인산화 억제에 의한 곤드레, 누룩치 그리고 산마늘의 신경 보호 효과

정미자; 박용일; 권기한

doi:10.3746/jkfn.2015.44.3.347

SK-N-SH 신경세포내 항산화 효과와 p38 인산화 억제에 의한 곤드레, 누룩치 그리고 산마늘의 신경 보호 효과
Neuroprotective Effects of Cirsium setidens, Pleurospermum kamtschaticumin, and Allium victorials Based on Antioxidant and p38 Phosphorylation Inhibitory Activities in SK-N-SH Neuronal Cells 원문보기

한국식품영양과학회지 = Journal of the Korean Society of Food Science and Nutrition, v.44 no.3, 2015년, pp.347 - 355

정미자 (광주대학교 식품영양학과) , 박용일 (가톨릭대학교 생명공학과) , 권기한 (광주대학교 식품영양학과)

초록
AI-Helper

신경계 질환은 산화적 스트레스에 의한 신경세포 손상에 의해 발생하는 것이 하나의 기전으로 알려져 있다. 본 연구는 $H_2O_2$에 의해 유도된 산화적 스트레스에 대항하여 곤드레(Cirsium setidens, CS), 누룩치(Pleurospermum kamtschaticumin, PK) 그리고 산마늘(Allium victorials, AV)의 뇌신경 보호 효과 및 그 기전에 대한 것이다. CS와 AV 처리는 대조군과 비교하여 $400{\mu}g/mL$까지 인간의 신경세포주인 SK-N-SH 세포에 대해 세포독성이 없었다. 산화적 유도자인 $H_2O_2$를 SK-N-SH 세포에 처리하였을 때 세포사멸 및 활성산소종(ROS) 생산이 현저하게 증가하였으나 CS 또는 AV 처리에 의해 산화적 스트레스에 의해 증가된 세포사멸과 ROS 생산이 현저하게 감소하였다. 실험한 산채 중에 CS와 PK가 AV보다 더 강한 DPPH 라디칼 소거 작용이 있었으나 PK는 대조군과 비교하여 SK-N-SH 세포를 사멸시키는 강한 세포독성을 가지고 있었다. CS는 AV보다 산화적 스트레스에 대항하여 세포사멸 및 ROS 생성에 더 높은 저해적 영향력을 보여주었다. 따라서 계속되는 실험에는 CS를 사용하였다. CS의 순차적 용매 분획물들인 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트, 부탄올 및 물 분획물들(CS-HE, CS-CH, CS-EA, CS-BU, CS-AQ)은 산화적 스트레스에 대항하여 SK-N-SH 세포사멸 및 세포내 ROS 생성을 억제하였다. CS-EA는 5개의 분획물들 중 가장 강한 DPPH 라디칼 소거작용 및 세포내 ROS 소거 활성을 가지고 있었고, 가장 강한 뇌신경세포 보호 효과를 가지고 있었다. CS-EA는 산화적 스트레스에 의해 증가된 세포자멸사(apoptosis)의 신호전달 경로에 관여하는 p38의 인산화를 저해함으로써 활성화되는 것을 약화시켰다. 이 결과들은 CS-EA가 뇌신경세포에서 항산화 효과 및 p38 인산화 억제에 의한 뇌신경 보호 효과를 나타낼 것이라 제안하였다.

Abstract ▼ AI-Helper

Oxidative stress is one of the key mechanisms involved in neuronal damage. Neuroprotective effects and underlying mechanisms of action of several wild vegetables, Cirsium setidens (CS), Pleurospermum kamtschaticumin (PK), and Allium victorials (AV), against oxidative stress induced by hydrogen peroxide in SK-N-SH cells were investigated. CS and AV up to $400{\mu}g/mL$ showed no detectable effects on cell viability of human SK-N-SH neuro-blastoma cells compared with control. Incubation of SK-N-SH cells with hydrogen peroxide resulted in significant induction of cell death and reaction oxygen species (ROS) production, whereas treatment of cells with CS and AV significantly reduced cell death and ROS production, respectively. Among the wild vegetables tested, CS and PK showed more effective DPPH radical scavenging activity than AV, whereas PK showed strong cytotoxicity in SK-N-SH cells compared with the control. CS showed much higher inhibitory effects on cell death and ROS generation against oxidative stress than AV. Thus, CS was selected for subsequent experiments. Ethyl acetate (EA), hexane, butanol, aqueous, and chloroform extracts from CS significantly inhibited cell death and ROS generation in SK-N-SH cells induced by oxidative stress. EA extract from CS (CS-EA) showed the highest DPPH radical-scavenging activity, intra-cellular ROS-scavenging activity, and neuroprotective effects. CS-EA attenuated apoptosis signal-regulating p38 activation by inhibiting phosphorylation. The findings suggest that CS-EA protects neuronal cells through antioxidant activity and inhibition of phosphorylation of p38 in brain neural cells.

주제어

AI 본문요약
AI-Helper

문제 정의

여러 연구 결과들은 곤드레, 누룩치 및 산마늘이 다양한 생체기능에 영향을 줄 가능성을 시사하고 있으나 뇌질환 개선 관련 연구들에 대한 보고는 전무하여 본 연구에서는 곤드레, 누룩치 그리고 산마늘의 뇌질환 개선을 위한 기능성 식･의약 소재로 개발 가능한지에 대한 기초 자료를 제공하고자 하였다.

제안 방법

SK-N-SH 세포내에서 산화적 스트레스(oxidative stress)의 유무 및 시료가 뇌신경세포내 ROS를 소거할 수 있는지를 확인하기 위해서 2,7-dichlorofluorescein diacetate(DCFDA)를 prove로 이용한 SK-N-SH 세포내 생성된 ROS 양을 측정하였다. 10 mM DCF-DA를 만들어 10 µM 농도가 되도록 PBS로 희석시켰다.
사람의 신경모세포종 SK-N-SH를 10% 비활성화 우태아 혈청(fetal bovine serum, FBS)과 1% 페니실린-스트렙토마이신 용액(penicillin/streptomycin)을 넣은 Eagle's Minimum Essential Medium(EMEM; ATCC, Manassas,VA, USA) 배양액으로 5% CO₂가 공급되는 배양기에서 37°C 조건으로 배양하였다.
동결 건조된 분말 형태의 곤드레 추출물(CS), 누룩치 추출물(PK) 그리고 산마늘 추출물(AV)은 -20°C의 냉동고에 보관하면서 시료로 사용하였다. 상기와 동일하게 곤드레 분말 시료 중량의 10배인 70% 에탄올을 첨가하여 실온에서 8시간 동안 3회 추출한 후 감압농축기를 사용하여 추출용매를 제거한 다음 얻은 70% 에탄올 농축물을 용매의 극성 차이에 따라 분리를 행하여 헥산(hexane), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 부탄올(butanol) 및 물(aqueous) 분획물 순서로 다섯 가지 분획물(CS-HE, CSCH, CS-EA, CS-BU, CS-AQ)을 제조하였다.

대상 데이터

강원도 양양에서 재배된 곤드레, 누룩치 그리고 산마늘을 구입하여 건조 후 분쇄하였다. 분말 시료 중량의 10배인 70% 에탄올을 첨가하여 실온에서 8시간 동안 3회 추출하였다.

데이터처리

본 실험 결과들은 평균(mean)±표준편차(standard deviation, SD)로 표시하였고 실험군 간 평균의 차이는 oneway ANOVA로 유의성을 확인한 후 Duncan's multiple range test를 이용하여 사후 검정하였으며 P<0.05 수준에서 유의성의 여부를 검증하였다. 모든 통계 분석은 SPSS(statistical package for the social science) version 12.

이론/모형

SK-N-SH 세포내 phospho-p38(p-p38) MAPK(mitogen-activated protein kinase)의 활성화를 알아보기 위해 시료를 처리한 세포에서 단백질을 분리하여 p38 MAPK의 인산화 정도를 MAPK(Thr180/Tyr182) Sandwich ELISAKit(Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA)을 사용하여 ELISA를 제조사의 방법에 따라 수행하였다.
배양이 끝난 SK-N-SH 세포의 생존율은 Kwon 등(3)이 사용한 MTT[3-(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,5-diphe-nylterazolium bromide] 환원 방법을 이용하여 측정하였다. 즉 각 well MTT 용액(5 mg/mL)을 성장배지의 10분의 1을 가해 주고 다시 37°C에서 4시간 더 배양하여 MTT를 환원시켜 생성된 formazon이 배지에 따라 나가지 않도록 배지를 조심스럽게 제거하였다.

성능/효과

9), 이는 CS-EA의 강한 항산화 효과에 기인된 것으로 생각된다. 따라서 곤드레 에틸아세테이트 분획물은 강한 항산화 효과에 의해 세포내에 생성되는 ROS를 소거함으로써 산화적 스트레스에 대항하여 뇌신경세포를 보호할 것이라고 추정된다.
본 연구 결과는 곤드레 에틸아세테이트 분획물(CS-EA)과 클로로포름(CS-CH)은 다른 분획물들과 비교하여 비슷하거나 더 효과적으로 산화적 스트레스로부터 뇌신경세포를 보호함으로써 뇌신경 사멸을 억제시켰고, 강한 산화적 스트레스에 오래 노출되어 뇌신경세포 사멸이 심하게 진행된 경우보다 뇌세포 사멸이 초기 단계에 있을 때 이들 분획물의 뇌신경세포 보호 효과가 더 뛰어났다. 따라서 초기 뇌 질환 환자들을 위해 CS-EA와 CS-CH는 뇌질환 개선을 위한 식･의약 소재로 활용 가능할 것으로 생각된다.

후속연구

Kim 등(20)은 누룩치의 추출물 및 분획물이 강한 항산화 효과 및 tyrosinase 저해 활성에 의한 미백 효과를 가지고 있어 식품 첨가물 및 화장품 원료 등 기능성 소재로 사용할 수 있을 것이라 하였는데, 본 연구 결과 누룩치 70% 에탄올 추출물은 저농도에서도 뇌신경세포를 사멸시키는 강한 세포독성을 가지고 있었으므로 기능성 소재로 활용하기 위해서는 안전성에 대한 과학적 근거를 반드시 확보하여야 할 것이다.
본 연구 결과는 곤드레 에틸아세테이트 분획물(CS-EA)과 클로로포름(CS-CH)은 다른 분획물들과 비교하여 비슷하거나 더 효과적으로 산화적 스트레스로부터 뇌신경세포를 보호함으로써 뇌신경 사멸을 억제시켰고, 강한 산화적 스트레스에 오래 노출되어 뇌신경세포 사멸이 심하게 진행된 경우보다 뇌세포 사멸이 초기 단계에 있을 때 이들 분획물의 뇌신경세포 보호 효과가 더 뛰어났다. 따라서 초기 뇌 질환 환자들을 위해 CS-EA와 CS-CH는 뇌질환 개선을 위한 식･의약 소재로 활용 가능할 것으로 생각된다.

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	누룩치에 풍부하게 함유된 성분은?	누룩치(Pleurospermum kamtschaticum)는 봄에 연한 잎줄기를 채취하여 날것으로 양념장에 찍어 먹거나 데쳐서 무침으로 먹기도 하고, 비타민 A, 회분, 인 등이 많은 것으로 알려져 있다(9). 누룩치는 소화촉진 효과, 항암 및 항당뇨(10) 효과가 보고된 바 있다.
	산마늘의 생리활성 효과는?	산마늘(Allium victrorialis Linne)은 백합과의 다년생 초본식물로서 식물 전체에서 강한 마늘냄새가 나며 맛은 맵고 성질은 약간 따뜻하며 독이 없다. 산마늘은 지질강하, 항비만, 항산화, 항당뇨, 간보호, 항암, 지질개선 등 다양한 생리활성 효과가 알려져 있다(11-17).
	한방에서 고려엉겅퀴의 용도는?	곤드레는 강원도 지역 특산물로서 매년 5월에 채취하여 맛이 담백하고 부드러우며 향이 독특하여 식용으로 사용되고 있다. 곤드레 어린 순은 다양한 요리에 이용되고 있고, 한방에서는 지혈,소염, 이뇨작용, 해열, 고혈압 등의 치료에 이용되어 왔으며(4), 영양학적으로 우수한 식품이고(5) 유전독성 억제 효과(6), 지방대사 개선 및 항산화 효과(7), 고지혈증 개선 효과(8) 등 인체에 유익한 약리 효능을 지니고 있고, 곤드레 주정 추출물을 함유한 모닝빵은 뇌신경 질환 예방 및 개선 효과가 있는 것으로 알려져 있으나(3) 곤드레 에탄올 추출물로부터 다양한 분획물의 뇌질환 개선 효과 및 그 기전에 대한 연구는 아직 보고되지 않았다.

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