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문제 정의
- , 2015). 따라서, 본 연구에서는 까마귀쪽나무 열매 70% 주정에탄올 추출물의 염증억제와 진통억제기능을 기반으로 한 건강기능식품을 개발하기 위하여 인체 적용시험용 시료(LJTM, test material of Litsea japonica. fruit)를제작하였으며, 까마귀쪽나무 열매의 주요 활성성분으로 확인된 hamabiwalatone B (Koo et al., 2014)의 함량을 평가하고, 본 시료의 인체적용시험 전 비임상효력을 확인하기 위하여 항염증 효과와 진통효과를 평가하고자 하였다. 또한, 본 인체 적용시험 시료의 골관절염에 대한 치료 및 예방효과를 MIA 유도 골관절염 동물모델에서 평가하여 인체적용시험 전의 효력을 확인하고자 하였다.
- , 2014)의 함량을 평가하고, 본 시료의 인체적용시험 전 비임상효력을 확인하기 위하여 항염증 효과와 진통효과를 평가하고자 하였다. 또한, 본 인체 적용시험 시료의 골관절염에 대한 치료 및 예방효과를 MIA 유도 골관절염 동물모델에서 평가하여 인체적용시험 전의 효력을 확인하고자 하였다.
- 이렇게 얻어진 조 추출물에 부형제를 첨가하여 1,000 g의 임상 시험제품을 제작하였으며, 까마귀쪽나무 열매에 대한 원료표준화 및 기준규격설정을 위해 설정한 지표성분인 hamabiwalatone B의 성분 함량 변화를 확인하였다(Table 2). 본 임상시험제품에 대한 인체 적용시험 전에 세포와 동물에서의 효능이 유지되는지 여부를 평가하기 위하여 본 임상시험제품을 다시 분말화하여 본 시험을 진행하였다.
- , 2006). 활성산소 중 하나이며, 염증 유발에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 NO 생성에 대한 LJTM의 효과를 알아보았다. 생성된 NO 양을 Griess 시약을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO2 -의 형태로 측정하였다.
- 본 연구는 까마귀쪽나무 열매 70% 주정에탄올 추출물을 가지고 제작된 인체적용시험시료(LJTM)의 항염증 및 골관절염 biomarker의 변화를 통한 관절건강 기능성식품을 개발하기 위하여 인체적용시험시료를 제작한 후 이에 대한 유효성분의 함량을 평가하고, 인체적용시험전에 그 효력이 유지됨을 확인하기 위하여 수행되었다. 본 연구에 사용된 시료 LJTMe NO 생성이 억제되는 농도에서 세포독성이 관찰되지 않았으며, TNF-α 와 IL-6 생성이 농도 의존적으로 억제되고 PGE2를 억제하였다.
제안 방법
- 동결건조된 까마귀쪽나무 열매 시료는 70% 주정에탄올(w/w, 시료의 20배)을 사용하여 60℃에서 15시간 동안 침출하였고 이를 여과한 후 감압농축한 뒤 동결건조기를 이용하여 추출물을 제작하였다. 임상시험 제품과 동일하게 까마귀쪽나무 열매 70% 주정에탄올 추출물 고형분 20%와 부형제(덱스트린, 결정셀룰로오스, 유당, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 이산화규소 등) 80%를 혼합하여 본 시험시료를 제작하였으며 이를 다시 분말화하여 본 실험에 사용하였다.
- 5 × 105 cells/㎖로 조절한 후 24 well plate 에 접종하고, 추출물 시료와 LPS (1 ㎍/㎖)를 동시에 처리하여 24시간 배양하였다. 생성된 NO의 양은 Griess 시약[1% (w/v) sulfanilamide, 0.1% (w/v) naphylethylenediamine in 2.5% (v/v) phosphoric acid]을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO2 -의 형태로 측정하였다. 세포배양 상등액 100 ㎕와 Griess 시약 100 ㎕를 혼합하여 96 well plates에서 10분 동안 반응시킨 후 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.
- 세포배양 상등액 100 ㎕와 Griess 시약 100 ㎕를 혼합하여 96 well plates에서 10분 동안 반응시킨 후 540 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 생성된 NO의 양은 sodium nitrite (NaNO2) 를 standard로 비교하였다.
- 5 × 105 cells/㎖)를 DMEM 배지에 추출물 시료와 LPS (1 ㎍/㎖)를 동시 처리하여 24시간 배양 한 후 배양 배지를 얻어 3, 000 rpm에서 5분간 원심분리 하였다. LDH (lactate dehydrogenase) assay는 non-radioactive cytotoxicity assay kit (Promega)를 이용하여 측정했으며, 96 well plate에 원심 분리하여 얻은 배양 배지 50 ㎕와 reconstituted substrate mix를 50 ㎕를 넣고, 실온에서 30분 반응시킨 후 50 ㎕의 stop solution을 넣은 후 microplate reader (Bio-TEK Instruments Inc., Vermont, WI, USA)를 사용하여 490 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군(LDH control, 1:5000)의 흡광도 값과 비교하여 세포독성을 평가하였다.
- , Vermont, WI, USA)를 사용하여 490 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료군에 대한 평균 흡광도 값을 구하였으며, 대조군(LDH control, 1:5000)의 흡광도 값과 비교하여 세포독성을 평가하였다.
- 5 × 105 cells/㎖)를 DMEM 배지를 이용하여 세포수를 조절한 후 24 well plate 에 접종하고, 5% CO2 항온기에서 18시간 전 배양하였다. 이후 배지를 제거하고 RAW 264.7 세포는 10배 농도(5, 10, 20 ㎍/㎖)로 조제된 추출물 시료 50 ㎕와 450 ㎕의 LPS (1 ㎍/㎖)를 함유한 새로운 배지를 동시에 처리하였고 전배양과 동일 조건에서 배양하였다. 24시간 후 배양 배지를 원심분리(12,000 rpm, 3분)하여 얻어진 상층액의 pro-inflammatory cytokines 생성 함량을 측정하였다.
- 7 세포는 10배 농도(5, 10, 20 ㎍/㎖)로 조제된 추출물 시료 50 ㎕와 450 ㎕의 LPS (1 ㎍/㎖)를 함유한 새로운 배지를 동시에 처리하였고 전배양과 동일 조건에서 배양하였다. 24시간 후 배양 배지를 원심분리(12,000 rpm, 3분)하여 얻어진 상층액의 pro-inflammatory cytokines 생성 함량을 측정하였다. 모든 시료는 정량 전까지 -20℃ 이하에 보관하였다.
- 까마귀쪽나무 열매 시험제품의 진통억제 효과를 평가하기 위하여 말초성 및 중추성 진통 억제 효과를 시험하였다. 말초성진 통 억제 효과는 실험동물 5주령 ICR mouse를 1주간 습도 50%, 온도 24∼26℃로 유지되는 사육장에서 순화시켰으며, 사료 및 물은 자유롭게 섭취할 수 있도록 공급하였다.
- 말초성진 통 억제 효과는 실험동물 5주령 ICR mouse를 1주간 습도 50%, 온도 24∼26℃로 유지되는 사육장에서 순화시켰으며, 사료 및 물은 자유롭게 섭취할 수 있도록 공급하였다. 자극물(초산 0.
- 말초성진 통 억제 효과는 실험동물 5주령 ICR mouse를 1주간 습도 50%, 온도 24∼26℃로 유지되는 사육장에서 순화시켰으며, 사료 및 물은 자유롭게 섭취할 수 있도록 공급하였다. 자극물(초산 0.75% 함유 생리 식염수)을 0.1 ㎖/10 g body wt의 용량으로 실험 전 12시간 동안 절식시킨 마우스의 복강에 주사로 주입하였으며, 자극물의 주입 60분 전 까마귀쪽나무 열매 추출물을 경구투여하였다. 자극물이 투입되면 복강 내에서 통증을 유발하여 몸을 뒤틀거나, 뒷다리를 쭉 뻗는 동작 등의 writhing syndrome 반응을 보이게 된다.
- 자극물이 투입되면 복강 내에서 통증을 유발하여 몸을 뒤틀거나, 뒷다리를 쭉 뻗는 동작 등의 writhing syndrome 반응을 보이게 된다. 총 10분 동안 writhing (몸을 뒤튼 상태로 2초 이상 지속) 횟수를 측정한 결과를 대상으로 평가하였다. 중추성 진통 억제 효능은 꼬리 회피 반응 시험법을 이용하였다.
- 중추성 진통 억제 효능은 꼬리 회피 반응 시험법을 이용하였다. 5 주령 ICR 마우스를 1주일간 순화시킨 후 각각 체중을 측정하고, 식별이 가능하도록 꼬리에 매직으로 표시를 하였다. 쥐 꼬리의 1/3지점을 측정해 표시하고, 반응에 영향을 미치지 않도록 빛이 닿지 않는 쪽에 표시를 하였다.
- 5 주령 ICR 마우스를 1주일간 순화시킨 후 각각 체중을 측정하고, 식별이 가능하도록 꼬리에 매직으로 표시를 하였다. 쥐 꼬리의 1/3지점을 측정해 표시하고, 반응에 영향을 미치지 않도록 빛이 닿지 않는 쪽에 표시를 하였다. 반응시간이 3∼4 sec가 되도록 강도를 맞추며, cut off timee 10 초 정도로 정하였다.
- 반응시간이 3∼4 sec가 되도록 강도를 맞추며, cut off timee 10 초 정도로 정하였다. 동물의 꼬리 끝을 열판에 올려놓고 꼬리치기가 일어나기까지의 시간을 측정하였으며, 대조군과 비교하여 꼬리치기가 일어나기까지의 시간 증가율을 구하였다.
- 사용하여 골관절염을 유발하였다. 먼저 1주간 습도 50%, 온도 24∼26℃로 유지되는 사육장에서 순화된 rat의 무릎 주변을 깨끗이 제모한 후 골관절염 유발물질인 MIA를 1 ㎖ 주사기를 사용하여 오른쪽 무릎 관절강 내에 50 ㎕ (60 ㎎/㎖) 씩투여하였으며, MIA 희석시에는 0.9% saline을 사용하였다. MIA 투여 7일 후 최종적으로 한쪽다리를 절뚝거리는 동물만을 선별하여 각 3마리씩 6군[정상대조군(NC), 골관절염 유도 대조군(OAC), LJTM 50, 100, 200 ㎎/㎏투여군, 양성대조군 (indomethacin 2 ㎎/㎏)]으로 분리하였으며, 3주 동안 시험물질을 경구투여 하였다.
- 9% saline을 사용하였다. MIA 투여 7일 후 최종적으로 한쪽다리를 절뚝거리는 동물만을 선별하여 각 3마리씩 6군[정상대조군(NC), 골관절염 유도 대조군(OAC), LJTM 50, 100, 200 ㎎/㎏투여군, 양성대조군 (indomethacin 2 ㎎/㎏)]으로 분리하였으며, 3주 동안 시험물질을 경구투여 하였다.
- 이루어졌다. 1 ㎍의 total RNA를 oligo (dT) 18 primer, dNTP (0.5 μM), 1 unit RNase inhibitor 그리고 M-MuLV reverse transcriptase (2U)로 70℃ 5 min, 25℃ 5 min, 37℃ 60 min, 그리고 70℃에서 10 min 간 heating 시킴으로서 cDNA 를 합성하였다. Quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR)을 위해, 2 ㎕의 cDNA, 12.
- 5 μM), 1 unit RNase inhibitor 그리고 M-MuLV reverse transcriptase (2U)로 70℃ 5 min, 25℃ 5 min, 37℃ 60 min, 그리고 70℃에서 10 min 간 heating 시킴으로서 cDNA 를 합성하였다. Quantitative real-time polymerase chain reaction (qRT-PCR)을 위해, 2 ㎕의 cDNA, 12.5 ㎕의 master mix [SYBR premix Ex Taq II (Takara, Japan)], 1 ㎕의 각각의 primer (Table 1), 8.5 ㎕의 DW를 혼합한 후 MX3005P (Stratagene, USA)을 이용하여 실시간으로 각 유전자의 발현양상을 측정하였다. 이때 PCR cyclee 95℃에서 10분 후, 95℃/15초와 60℃/60초를 40 cycle 동안 반복하였으며, 각각의 측정된 유전자들의 cycle threshold (CT)는 대조군과 비교하여 발현량을 산출하였다.
- 5 ㎕의 DW를 혼합한 후 MX3005P (Stratagene, USA)을 이용하여 실시간으로 각 유전자의 발현양상을 측정하였다. 이때 PCR cyclee 95℃에서 10분 후, 95℃/15초와 60℃/60초를 40 cycle 동안 반복하였으며, 각각의 측정된 유전자들의 cycle threshold (CT)는 대조군과 비교하여 발현량을 산출하였다.
- 조추출물 251 g을 얻었다. 이렇게 얻어진 조 추출물에 부형제를 첨가하여 1,000 g의 임상 시험제품을 제작하였으며, 까마귀쪽나무 열매에 대한 원료표준화 및 기준규격설정을 위해 설정한 지표성분인 hamabiwalatone B의 성분 함량 변화를 확인하였다(Table 2). 본 임상시험제품에 대한 인체 적용시험 전에 세포와 동물에서의 효능이 유지되는지 여부를 평가하기 위하여 본 임상시험제품을 다시 분말화하여 본 시험을 진행하였다.
- 활성산소 중 하나이며, 염증 유발에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 NO 생성에 대한 LJTM의 효과를 알아보았다. 생성된 NO 양을 Griess 시약을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO2 -의 형태로 측정하였다. 그 결과 LJTM이 대조군인 LPS 단독처리군에 비해 농도 의존적으로 높은 NO 생성 억제효과를 관찰할 수 있었다(Fig.
- 초산 유도 진통효력시험은 말초신경계에 작용하는 진통효력시험법으로 초산을 복강에 주입하였을 경우 PGE2의 농도가 증가하여복막액의 lipoxygenase가 증가하게 되며, 이에 따른 비정상적인 수축이 일어나 통증의 반응으로써 writhing syndrome을 나타내게 된다(Dannerman, 1977). 이에 본 연구에서는 말초신경계에 작용하는 LJTM의 진통 효능을 측정하기 위해 초산유도 진통효력시험법을 이용하였으며, 시험 시작 60분 전에 LJTM을경구투여 하였다. 그 결과, Fig.
- 의미한다(Kraus, 1997). 그 중 matrix metalloproteinases (MMPs)와 tissue inhibitor of metalloproteinases (TIMPs) 등의 여러가지 효소들은 대표적으로 연골기질의 분해와 관련되어 있는 것으로 알려져 있으며, 이에 본 연구에서는 MIA에 인해 유발된 골관절염 모델에서 MMP 및 TIMP 등의 생화학적 지표변화를 확인하기 위해 물질 투여 3주 후 연골조직을 분리하여 골 및 연골의 기지 구성요소를 파괴하는 생화학적 지표인 MMP-2, 3, 7, 9와 TIMP-1, 2에 대한 mRNA 발현 정도를 qRT-PCR을 통하여 확인하였다. 그 결과, LJTM 50, 100 및 200 ㎎/㎏를 투여한 군은 골관절염 유발 대조군과 비교하여 농도 의존적으로 MMPs와 TIMPs의 발현을 감소시켰으며, 특히 LJTM 200 ㎎/㎏ 투여군은 양성대조군인 indomethacin 2 ㎎/㎏ 투여군보다 더 적은 발현량을 나타내었다(Fig.
대상 데이터
- 제주도 하천 일대에 자생하고 있는 까마귀쪽나무(Litsea japonica) 열매를 2014년 6월경에 채집하였으며, 채집된 시료는 증류수로 2~3회 수세한 뒤 종자를 제거하고 동결건조한 후마쇄기로 분쇄하여 추출용 시료로 사용하였다.
- 임상시험 제품과 동일하게 까마귀쪽나무 열매 70% 주정에탄올 추출물 고형분 20%와 부형제(덱스트린, 결정셀룰로오스, 유당, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 이산화규소 등) 80%를 혼합하여 본 시험시료를 제작하였으며 이를 다시 분말화하여 본 실험에 사용하였다.
- 대식세포 계열(Murine macrophage cell line)인 RAW 264.7 세포는 American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA)에서 구입하여 10% fetal bovine serum (FBS)와 penicillin- streptomycin 100 units/㎖이 함유된 DMEM 배지(GIBCO, Grand Island, NY, USA)를 사용하여 37℃, 5% CO2 항온기에서 배양하였으며, 3일에 한 번씩 계대배양을 시행하였다.
데이터처리
- 모든 실험은 3회 이상 반복으로 이루어졌으며, 실험 결과는 각 항목에 따라 평균치 ± 표준오차(SE)를 구하여 신뢰수준 95% (p < 0.05)에서 통계적 유의차를 평가하였다.
이론/모형
- 모든 시료는 정량 전까지 -20℃ 이하에 보관하였다. Pro-inflammatory cytokines 정량은 mouse enzyme-linked immnunosorbent assay (ELISA) kit (R&D Systems Inc., Minneapolis, MN, USA) 를 이용하여 정량하였으며 standard 에 대한 표준곡선의 r2값은 0.99 이상이었다.
- 총 10분 동안 writhing (몸을 뒤튼 상태로 2초 이상 지속) 횟수를 측정한 결과를 대상으로 평가하였다. 중추성 진통 억제 효능은 꼬리 회피 반응 시험법을 이용하였다. 5 주령 ICR 마우스를 1주일간 순화시킨 후 각각 체중을 측정하고, 식별이 가능하도록 꼬리에 매직으로 표시를 하였다.
- The production of nitric oxide was assayed in the culture medium of cells stimulated with LPS (1 ㎍/㎖) for 24 h in the presence of LJTM (5, 10, and 20 ㎍/㎖). Cytotoxicity was determined using the LDH method. Values are the mean ± SEM of triplicate experiments (*P < 0.
- 중추신경계에 작용하는 진통 효능을 측정하기 위해 본 연구에서는 급성 통증 모델 중 중추신경계에 작용하는 진통제를 검색할 때 널리 사용되고 있는 방법인 꼬리회피반응시험법을 이용하였다. 그 결과, LJTM을 투여하였을 경우 꼬리 회피 반응시간이 지연됨을 알 수 있었다(Fig.
성능/효과
- 생성된 NO 양을 Griess 시약을 이용하여 세포배양액 중에 존재하는 NO2 -의 형태로 측정하였다. 그 결과 LJTM이 대조군인 LPS 단독처리군에 비해 농도 의존적으로 높은 NO 생성 억제효과를 관찰할 수 있었다(Fig. 1A).
- , 2007). RAW 264.7 cell에 LJTM (5, 10, 20 ㎍/㎖)과 LPS (1 ㎍/㎖)를 동시 처리하여 24시간 배양한 후 PGE ₂ELISA assay kit를 이용하여 PGE₂ 생성 억제 활성을 확인한 결과, 농도 의존적으로 PGE2 생성 억제 활성을 관찰할 수 있었다(Fig. 1B).
- , 2009). 대식세포인 RAW 264.7 세포로부터 pro- inflammatory cytokine의 생성 억제 정도를 확인한 결과, LPS 자극제와 LJTM을 함께 처리하여 TNF-α와 IL-6 생성이 농도 의존적으로 억제하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2).
- 이에 본 연구에서는 말초신경계에 작용하는 LJTM의 진통 효능을 측정하기 위해 초산유도 진통효력시험법을 이용하였으며, 시험 시작 60분 전에 LJTM을경구투여 하였다. 그 결과, Fig. 3에서 나타난 바와 같이, 시료 비투여군인 대조군의 writhing 횟수에 비하여 LJTM을 경구투여 한 동물에서 writhing 횟수가 적게 측정되었다(Fig. 3A).
- 그 결과, LJTM을 투여하였을 경우 꼬리 회피 반응시간이 지연됨을 알 수 있었다(Fig. 3B). 따라서, 본 연구의 LJTM 은 말초신경계와 중추신경계에 모두 작용하여 통증 감소 효과를 나타내며, 통증완화를 통해 골관절염의 임상증상을 감소시킬 수 있을 것이라 사료된다.
- 그 중 matrix metalloproteinases (MMPs)와 tissue inhibitor of metalloproteinases (TIMPs) 등의 여러가지 효소들은 대표적으로 연골기질의 분해와 관련되어 있는 것으로 알려져 있으며, 이에 본 연구에서는 MIA에 인해 유발된 골관절염 모델에서 MMP 및 TIMP 등의 생화학적 지표변화를 확인하기 위해 물질 투여 3주 후 연골조직을 분리하여 골 및 연골의 기지 구성요소를 파괴하는 생화학적 지표인 MMP-2, 3, 7, 9와 TIMP-1, 2에 대한 mRNA 발현 정도를 qRT-PCR을 통하여 확인하였다. 그 결과, LJTM 50, 100 및 200 ㎎/㎏를 투여한 군은 골관절염 유발 대조군과 비교하여 농도 의존적으로 MMPs와 TIMPs의 발현을 감소시켰으며, 특히 LJTM 200 ㎎/㎏ 투여군은 양성대조군인 indomethacin 2 ㎎/㎏ 투여군보다 더 적은 발현량을 나타내었다(Fig. 4). 일반적으로 MMP-1 과 -3는 TIMP에 의해 억제된다고 보고되어 있으나, 최근 연구자료에 의하면 MMPs와 TIMP는 정상에 비해 골관절염이 유도된 동물의 연골에서 모두 증가된다고 보고되어 있으며, 다만 TIMP에 비해 MMP의 농도가 상대적으로 증가하여 연골분해를 일으킨다고 알려져 있다(Jin et al.
- 위하여 수행되었다. 본 연구에 사용된 시료 LJTMe NO 생성이 억제되는 농도에서 세포독성이 관찰되지 않았으며, TNF-α 와 IL-6 생성이 농도 의존적으로 억제되고 PGE2를 억제하였다. 또한 동물시험에서 골관절염의 biomarker인 MMP-2, 3, 7, 9 와 TIMP-1, 2에 대한 mRNA 발현이 농도 의존적으로 억제되었으며, 중추신경계 및 말초신경계에 의한 통증을 억제하는 것으로 평가되었다.
- 본 연구에 사용된 시료 LJTMe NO 생성이 억제되는 농도에서 세포독성이 관찰되지 않았으며, TNF-α 와 IL-6 생성이 농도 의존적으로 억제되고 PGE2를 억제하였다. 또한 동물시험에서 골관절염의 biomarker인 MMP-2, 3, 7, 9 와 TIMP-1, 2에 대한 mRNA 발현이 농도 의존적으로 억제되었으며, 중추신경계 및 말초신경계에 의한 통증을 억제하는 것으로 평가되었다. 따라서 까마귀쪽나무 열매 70% 추출물이 함유된 인체적용시험시료(LJTM)는 골관절염과 진통억제에 우수한 효과가 있는 것으로 확인되었다.
- 또한 동물시험에서 골관절염의 biomarker인 MMP-2, 3, 7, 9 와 TIMP-1, 2에 대한 mRNA 발현이 농도 의존적으로 억제되었으며, 중추신경계 및 말초신경계에 의한 통증을 억제하는 것으로 평가되었다. 따라서 까마귀쪽나무 열매 70% 추출물이 함유된 인체적용시험시료(LJTM)는 골관절염과 진통억제에 우수한 효과가 있는 것으로 확인되었다.
후속연구
- 3B). 따라서, 본 연구의 LJTM 은 말초신경계와 중추신경계에 모두 작용하여 통증 감소 효과를 나타내며, 통증완화를 통해 골관절염의 임상증상을 감소시킬 수 있을 것이라 사료된다.
- , 1994). 이에 본 연구의 LJTMe 이러한 연골기질 분해와 관련된 효소인 MMPs와 TIMPs를 모두 억제하였으므로, 골관절염으로 인해 발생하는 연골파괴를 예방할 수 있을 것으로 사료된다.
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