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문제 정의
- 따라서 본 실험에서는 대나무 줄기의 마디부분의 표면에서 발견된 신균주 B.amyloliquefaciens NBF11-1을 이용한 청국장 추출물을 실험군으로 하고, 청국장 발효의 대표적인 균주로 알려진 B.subtilis NG24를 이용한 청국장 추출물을 대조군으로 정하여 항균 활성, 최소억제농도를 비교분석하고, 열 및 pH 안정성도 함께 조사해 봄으로써 B.amyloliquefaciens NBF11-1을 이용하여 발효한 청국장의 기능성을 확인할 수 있는 기초자료로 사용함을 목적으로 한다.
- 연구의 목적은 대나무 줄기의 마디부분의 표면에서 발견하였으나, 아직까지는 연구가 미흡한 신균주인 B.amyloliquefaciens NBF11-1을 이용하여 발효한 청국장의 항균활성의 효능을 알아보려고 한다. 혈중 콜레스테롤 저하 및 당뇨 개선 효과[14]를 가지고 있는 청국장의 대표적인 발효균주인 B.
제안 방법
- B.subtilis NG24와 신균주 B.amyloliquefaciens NBF11-1을 이용하여 발효시킨 청국장의 항균활성도를 확인하기 위하여 70 % ethanol로 추출한 후, paper disc 법을 이용하여 그람 양성균주 3종, 그람 음성균주 3종에 대하여 실험을 실시하였다. 청국장 에탄올 추출물은 4 mg/mL 농도에서 병원성 균주 6종 전체에서 항균효과를 보였고, 두 균주간 결과는 다음과 같다(Table 3).
- MHB를 10 ㎏씩 두개를 제조한 다음 B.subtilis NG24와 신균주 B.amyloliquefaciens NBF11-1을 이용하여 배양되어 있는 slant broth tube에서 Loop로 채취하여 각 broth flask에 넣는다[Table 2]. 진탕 배양기를 이용하여 종균액을 37℃, 24시간 배양한 다음 5 ㎖ tube에 각각 100 ㎕씩 24시간 배양하였다.
- pH 안정성 실험은 B.subtilis NG24와 B.amyloliquefaciens NBF11-1을 이용하여 발효시킨 청국장의 70 % ethanol 추출물을 4 mg/mL 농도로 희석하였다. 희석한 시료의 pH를 0.
- 각 균주는 액체배지에서 37℃, 24시간 배양하여 세균 배양액을 650 nm에서 Optical Density(O.D) 값 0.4[106 CFU(Colony Forming Unit)/mL]가 되게 조절한 후 활성화시킨 다음 병원성 균주 6종이 배양된 배지에 1회 백금이로 균을 채취해 2.5㎖ MHB의 생육액체배지에 현탁시켜 배양한 후 높이가 4∼5 mm인 MHA 배지를 만들어 하루정도 건조시킨 후 시험균액 40 ㎕을 무균상태에서 Plate에 분주한 후 멸균된 유리막대로 잘 도말한다.
- 대두는 100 g 씩 10개의 비커에 나누어 담고 전날 배양한 두 종균액을 전체의 1 % (w/w)가 되도록 5개의 비커에 나누어서 접종하였다. 균주를 접종한 대두를 37℃, 24시간 동안 발효시켜 100g을 뺀 나머지를 -70℃, 24시간 냉동시킨 후 동결건조 된 시료 중 400 g을 3배의 70 % ethanol로 실온, 24시간 3회 반복하여 진탕한 후 상층액 시료를 추출하였다. 추출액은 여과지(Whatman No.
- 침지한 대두를 고압증기 멸균기에서 115℃, 25분간 증자하고, 50-60℃로 냉각하였다. 대두는 100 g 씩 10개의 비커에 나누어 담고 전날 배양한 두 종균액을 전체의 1 % (w/w)가 되도록 5개의 비커에 나누어서 접종하였다. 균주를 접종한 대두를 37℃, 24시간 동안 발효시켜 100g을 뺀 나머지를 -70℃, 24시간 냉동시킨 후 동결건조 된 시료 중 400 g을 3배의 70 % ethanol로 실온, 24시간 3회 반복하여 진탕한 후 상층액 시료를 추출하였다.
- 본 실험은 B.subtilis NG24와 신균주 B.amyloliquefaciens NBF11-1에 의한 청국장 추출물 시료를 가지고 항균활성을 비교분석 하였고, Paper disc diffusion method[20]을 응용하여 사용하였다. 각 균주는 액체배지에서 37℃, 24시간 배양하여 세균 배양액을 650 nm에서 Optical Density(O.
- 본 실험은 멸균 후 완전히 굳지 않은 MHA 배지에 B.subtilis NG24와 신균주 B.amyloliquefaciens NBF11-1을 이용하여 발효시킨 청국장의 70 % ethanol 추출물을 0.3-0.01 %(w/v) 범위의 농도별로 최종 맞춰 첨가하고 여기에 시험 균주의 농도가 약 105∼106 CFU 가량 되도록 접종한 후 혼합하였다.
- subtilis NG24을 이용하여 발효한 청국장을 대조군으로 하였다. 실험방법은 병원성 균주 6종을 대상으로 항균활성, 최소억제농도와 열 및 pH 안정성을 비교분석하였다.
- 열 안정성(Heat stability) 실험은 B.subtilis NG24와 B.amyloliquefaciens NBF11-1을 이용하여 발효시킨 청국장의 70 % ethanol 추출물을 4 mg/mL 농도로 희석하였다. 희석한 시료를 60℃에서 10, 30 및 60분, 80℃ 및 100℃에서 10분과 20분, 121℃에서 15분간 열처리한 후 즉시 냉각하였다.
- 각 청국장 추출물을 에탄올을 이용하여 4 mg/mL 농도로 희석한 다음 시료를 30 ㎕ 씩 지름이 8 mm인 멸균된 paper disc에 흡수시켜 균주가 도말된 배지 표면에 고정시켰다. 이를 실온, 1시간동안 확산, 건조시킨 후 24시간동안 배양하였으며, 각 추출물로부터 형성된 disc 주위에 생성된 환의 모습을 clear zone의 크기로 판단하였다.
- 현재 대부분의 가공 식품들은 제품 고유의 특성을 살리거나, 저장성과 기호성을 향상시키기 위해 열처리 또는 pH의 처리 과정을 거치게 되므로 이들 식품에 첨가되는 보존료는 열 및 pH에 안정성이 있어야 한다. 이에 B.subtilis NG24와 신균주 B.amyloliquefaciens NBF11-1에 의한 청국장 추출물의 열 및 pH의 안정성을 측정하였다. 열 안정성 실험 결과, B.
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subtilis NG24와 B.amyloliquefaciens NBF11-1에 의한 FS의 최소억제농도
최소억제농도(Minimal Inhibitory Concentration, MIC) 실험은 한천배지 확산법을 응용하여 비교분석을 실시하였다[21
]. 본 실험은 멸균 후 완전히 굳지 않은 MHA 배지에 B. - amyloliquefaciens NBF11-1을 이용하여 발효시킨 청국장의 70 % ethanol 추출물을 4 mg/mL 농도로 희석하였다. 희석한 시료를 60℃에서 10, 30 및 60분, 80℃ 및 100℃에서 10분과 20분, 121℃에서 15분간 열처리한 후 즉시 냉각하였다. 이렇게 처리된 시료의 항균활성 변화 를 paper disc법[20]으로 측정하였다.
- amyloliquefaciens NBF11-1을 이용하여 발효시킨 청국장의 70 % ethanol 추출물을 4 mg/mL 농도로 희석하였다. 희석한 시료의 pH를 0.1 N NaOH와 0.1 N HCl을 이용하여 2, 4, 6, 8 및 10으로 조절한 후 실온에서 24시간 동안 방치하였다. 이렇게 방치한 시료는 0.
대상 데이터
- 청국장 추출물의 병원성 균주들에 대한 항균효과를 측정하기 위한 6종 균주로 Gram Positive 균주는 Enterococcus faecalis, Clostridium perfringens, Staphylococcus aureus를 사용하였고, Gram Negative 균주는 Alcaligenes faecalis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa이다. 각 균주는 한국 미생물보존센터에서 분양을 받아 항균 활성 실험에 사용하였으며, 균주의 배양조건은 다음과 같다[Table 1].
- 고초균 생육배지는 NB(Nutrient broth, Difco, Becton Dicnson Co., USA)를 사용하였고, 항균활성에 사용한 배지는 Mueller Hinton Broth & Mueller Hinton Agar(MHB & MHA, Difco, Becton Dicnson Co., USA)를 구입하여 사용하였다.
- 본 실험에서 청국장 발효에 이용되고 있는 대표적인 균주 B.subtilis NG24와 대나무 줄기의 마디부분의 표면에서 처음 분리된 신균주 B.amyloliquefaciens NBF11-1을 사용하였다. 목포대학교 생물학과 미생물학 실험실에 보관중인 청국장 발효균주 B.
- 본 연구에서 사용한 대두(국산)는 2014년 용두농업 협동조합(무안)에서 1 ㎏을 구매하여 본 항균활성과 최소억제농도와 열 및 pH 안정성 실험에 사용하였다.
- 실험 기기로는 Shaking incubator, UV/Visible spectrophotometer, Freezing dryer와 Rotary vacuum evaporator외 일반 실험기구들을 사용하였다. 추출용 시약은 70 % ethanol을 사용하였다.
- 청국장 추출물의 병원성 균주들에 대한 항균효과를 측정하기 위한 6종 균주로 Gram Positive 균주는 Enterococcus faecalis, Clostridium perfringens, Staphylococcus aureus를 사용하였고, Gram Negative 균주는 Alcaligenes faecalis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa이다. 각 균주는 한국 미생물보존센터에서 분양을 받아 항균 활성 실험에 사용하였으며, 균주의 배양조건은 다음과 같다[Table 1].
- 실험 기기로는 Shaking incubator, UV/Visible spectrophotometer, Freezing dryer와 Rotary vacuum evaporator외 일반 실험기구들을 사용하였다. 추출용 시약은 70 % ethanol을 사용하였다. 고초균 생육배지는 NB(Nutrient broth, Difco, Becton Dicnson Co.
- amyloliquefaciens NBF11-1을 이용하여 발효한 청국장의 항균활성의 효능을 알아보려고 한다. 혈중 콜레스테롤 저하 및 당뇨 개선 효과[14]를 가지고 있는 청국장의 대표적인 발효균주인 B.subtilis NG24을 이용하여 발효한 청국장을 대조군으로 하였다. 실험방법은 병원성 균주 6종을 대상으로 항균활성, 최소억제농도와 열 및 pH 안정성을 비교분석하였다.
이론/모형
- 1 N HCl을 이용하여 2, 4, 6, 8 및 10으로 조절한 후 실온에서 24시간 동안 방치하였다. 이렇게 방치한 시료는 0.1 N NaOH와 0.1 N HCl을 사용하여 본래의 pH로 중화시켜 4 mg/mL 농도로 희석하여 항균활성 변화를 paper disc법[20]으로 측정하였다.
- 희석한 시료를 60℃에서 10, 30 및 60분, 80℃ 및 100℃에서 10분과 20분, 121℃에서 15분간 열처리한 후 즉시 냉각하였다. 이렇게 처리된 시료의 항균활성 변화 를 paper disc법[20]으로 측정하였다.
성능/효과
- amyloliquefaciens NBF11-1에 의한 청국장 추출물을 121℃에서 15분간 열처리를 하여도 항균활성에 변화가 없었다. B.subtilis NG24와 더불어 B.amyloliquefaciens NBF11-1 청국장 추출물도 열에 안정성을 확인할 수 있는 물질임을 알 수 있었다(Table 5). 이러한 결과로 볼 때, B.
- 55 %로 차이는 없었다. C.perfringens에서는 0.15 %, 0.01 %이었고, S.aureus에서는 0.40 %, 0.21 %로 B.amyloliquefaciens NBF11-1의 최소억제농도가 B.subtilis NG24보다 높았다. 그람 음성균주 중 A.
- perfringens와 같이 retort 및 통조림 제품에서 변패나 식중독을 일으킬 수 있는 균주에 대해서도 열처리 시 항균활성에 변화가 없는 것으로 나타나 통조림이나 retort 제품의 상업적 멸균 시 이용할 수 있을 것으로 기대가 된다. pH 안정성 실험 결과, B.subtilis NG24와 B.amyloliquefaciens NBF11-1에 의한 청국장 추출물은 pH 2-8의 범위에서 모두 항균활성이 잘 유지되었다. 알칼리 조건인 pH 10에서 B.
- subtilis NG24와 더불어 열에 안전한 천연물질임을 알 수 있었다. pH 안정성 실험 결과에서는 B.amyloliquefaciens NBF11-1과 B.subtilis NG24를 이용한 추출물을 pH 2-8로 처리해도 변화가 없었으며, 알칼리인 pH 10에서 B.subtilis NG24에 비해 B.amyloliquefaciens NBF11-1에 항균활성의 변화가 없어 이들 추출물 유래의 항균물질은 가공식품을 만들기 위한 조건인 열 및 pH 변화에도 안정한 천연물질임을 알 수 있었다.
- 그람 음성균주 중 A.faecalis에서는 B.subtilis NG24는 1.50 %, 0.45 %이었고, E.coli에서는 >0.80 %, 0.29%로 B.amyloliquefaciens NBF11-1의 항균효과가 B.subtilis NG24보다 높은 것으로 나타났지만, P.aeruginosa에서는 두 군간에 효과가 없었다.
- 21 % 농도로 생육을 억제하는 효과가 있었다. 그람 음성균주 중 P.aeruginosa을 제외한 A.faecalis 와 E.coli는 B.subtilis NG24에 비해 B.amyloliquefaciens NBF11-1에서 0.45 % 및 0.29 % 농도에서 생육을 억제 하는 효과가 있었다. 열 안전성 실험 결과는 B.
- 청국장 에탄올 추출물은 4 mg/mL 농도에서 병원성 균주 6종 전체에서 항균효과를 보였고, 두 균주간 결과는 다음과 같다(Table 3). 그람양성에서 E.faecalis는 항균효과의 차이가 없었으나, C.perfringens와 S.aureus가 B.subtilis NG24에 비해 B.amyloliquefaciens에서 높은 항균효과를 보였다. 그람음성에서 P.
- amyloliquefaciens NBF11-1에서 높은 항균활성을 보였다. 그람음성에서 P.aeruginosa는 항균활성이 없었으며, A.faecalis와 E.coli에서는 B.subtilis NG24에 비해 B.amyloliquefaciens NBF11-1에서 높은 항균활성을 보였다. 최소억제농도 실험에서는 그람 양성균주 중 E.
- amyloliquefaciens에서 높은 항균효과를 보였다. 그람음성에서 P.aeruginosa는 항균효과의 차이가 없었으나, A.faecalis와 E.coli에서는 B.subtilis NG24에 비해 B.amyloliquefaciens에서 높은 항균효과를 보였다. Yang 등[22]의 연구에서는B.
- amyloliquefaciens NBF11-1에 의한 청국장 추출물 모두에서 100℃, 20분까지는 열처리를 하여도 항균활성에 변화가 없었다. 따라서, B.amyloliquefaciens NBF11-1 추출물도 B.subtilis NG24와 더불어 열에 안전한 천연물질임을 알 수 있었다. pH 안정성 실험 결과에서는 B.
- 본 항균 실험의 결과에서는 B.subtilis NG24를 이용하여 발효한 청국장에 비하여 B.amyloliquefaciens NBF11-1로 발효한 청국장의 항균효과가 그람양성 E.faecalis는 항균활성의 차이가 없었고, C.perfringens와 S.aureus가 B.subtilis NG24에 비해 B.amyloliquefaciens NBF11-1에서 높은 항균활성을 보였다. 그람음성에서 P.
- 29 % 농도에서 생육을 억제 하는 효과가 있었다. 열 안전성 실험 결과는 B.subtilis NG24와 B.amyloliquefaciens NBF11-1에 의한 청국장 추출물 모두에서 100℃, 20분까지는 열처리를 하여도 항균활성에 변화가 없었다. 따라서, B.
- amyloliquefaciens NBF11-1에 의한 청국장 추출물의 열 및 pH의 안정성을 측정하였다. 열 안정성 실험 결과, B.subtilis NG24와 B.amyloliquefaciens NBF11-1에 의한 청국장 추출물을 121℃에서 15분간 열처리를 하여도 항균활성에 변화가 없었다. B.
- amyloliquefaciens의 구성되어 있는 단백질막의 변성 변화가 나타나지 않았다고 하였다(31). 이는 청국장을 포함한 일반적인 가공식품의 pH가 약산성 또는 중성임을 고려할 때, pH 10의 알칼리 조건에서 B.subtilis NG24에 비해 B.amyloliquefaciens NBF11-1 추출물이 적정수준의 항균활성을 유지하는 것은 B.amyloliquefaciens NBF11-1을 이용한 천연 식품보존제도 B.subtilis NG24와 더불어 안정된 물질임을 확인할 수 있었다. 또한, 산성 및 중성조건에서는 항균활성이 그대로 유지됨으로 유통 중 미생물 생육 억제 효과를 지속적으로 얻을 수 있어 B.
- amyloliquefaciens NBF11-1에서 높은 항균활성을 보였다. 최소억제농도 실험에서는 그람 양성균주 중 E.faecalis를 제외한 C.perfringens와 S. aureus는 B.subtilis NG24에 비해 B.amyloliquefaciens NBF11-1에서 0.01 % 및 0.21 % 농도로 생육을 억제하는 효과가 있었다. 그람 음성균주 중 P.
후속연구
- 따라서, 향후의 연구에서는 B.subtilis NG24에 비해 신균주 B.amyloliquefaciens NBF11-1을 이용한 발효가 청국장 점질물의 기능 중 항균활성에 영향을 준 물질들에 대해 세부적으로 파악하고 그 구조적, 기능적 특성들을 비교분석을 하여 항균작용에 있어 두 물질의 상승효과 등에 대한 연구가 함께 실행되어져야 할 것으로 사료 된다.
- subtilis NG24와 더불어 안정된 물질임을 확인할 수 있었다. 또한, 산성 및 중성조건에서는 항균활성이 그대로 유지됨으로 유통 중 미생물 생육 억제 효과를 지속적으로 얻을 수 있어 B.amyloliquefaciens NBF11-1의 추출물은 열과 pH에 비교적 안정성을 나타냄으로서 식품의 가공처리에도 적합한 천연가공식품으로 활용 가능성이 높을 것으로 사료된다.
- amyloliquefaciens NBF11-1에 의한 청국장 추출물은 가공과정에서 열처리를 동반하는 대부분의 식품 보존제로 사용하기 용이할것으로 보여진다. 특히, B.amyloliquefaciens에 의한 발효 추출물은 C.perfringens와 같이 retort 및 통조림 제품에서 변패나 식중독을 일으킬 수 있는 균주에 대해서도 열처리 시 항균활성에 변화가 없는 것으로 나타나 통조림이나 retort 제품의 상업적 멸균 시 이용할 수 있을 것으로 기대가 된다. pH 안정성 실험 결과, B.
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