[논문]반응표면분석법을 이용한 Aureobasidium pullulans MR의 풀루란 생산을 위한 배양 조건 최적화

조혜미; 김예진; 유상호; 김창무; 김계원; 박천석

doi:10.9721/kjfst.2021.53.2.195

반응표면분석법을 이용한 Aureobasidium pullulans MR의 풀루란 생산을 위한 배양 조건 최적화
Optimization of cultivation conditions for pullulan production from Aureobasidium pullulans MR by response surface methodology 원문보기

한국식품과학회지 = Korean journal of food science and technology, v.53 no.2, 2021년, pp.195 - 203

조혜미 (경희대학교 식품생명공학과) , 김예진 (경희대학교 식품생명공학과) , 유상호 (세종대학교 식품공학과) , 김창무 (국립생물자원관 미생물자원과) , 김계원 (국립한경대학교 산학협력단) , 박천석 (경희대학교 식품생명공학과)

초록
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본 연구에서는 A. pullulans MR의 풀루란 생산에 있어 배양 조건에 따른 변화를 살펴보았다. 먼저 시간과 온도에 따른 건조된 균체량과 풀루란 생산량의 변화를 비교하였으며, 기존의 AYS배 지내 탄소원과 혼합질소원 변화에 따른 풀루란 생산량을 비교하였다. 그 결과 sucrose와 ammonium sulfate, soy peptone을 본 실험의 최적 탄소원과 혼합질소원으로 결정하였으며, 그 후 반응표면분석법을 통해 탄소원인 sucrose와 질소원인 soy pepetone의 최적 농도와 최적 초기 pH를 알 수 있었다. 분산분석 결과를 토대로 비교하였을 때 A. pullulans MR의 풀루란 생산에 있어 세가지 변수 중 특히 초기 pH가 풀루란 생산에 가장 큰 영향을 미친다는 것을 확인하였다. 결과적으로 A. pullulans MR을 26℃에서 5일간 배양할 경우 반응표면분석법을 이용하여 얻은 최적 배양 조건은 sucrose 15%, soy peptone 0.4%, 초기 pH 7이였으며, 위의 배양 조건에서 예측할 수 있는 풀루란의 최대생산량은 47.6 g/L이었다. 이후 확인 실험을 위해 A. pullulans MR을 동일 조건으로 배양한 뒤 풀루란의 생산량을 관찰한 결과 48.9±3.4 g/L로 예측된 값과 근접한 값을 얻을 수 있었다. 추가적으로, sucrose의 경우 기존의 선행연구들에서도 A. pullulans의 풀루란 생산을 위한 탄소원으로 보고가 되었지만, 배지내 sucrose의 함량이 5%를 초과하게 될 경우 오히려 풀루란의 생성을 저해한다는 결과가 보고된 바가 있다(Shin 등, 1987b). 이는 배지내 sucrose의 함량이 높아 질수록 sucrose의 농도에 의한 삼투압 현상과 낮은 수분활성도로 인해 발생하며(Singh 등, 2009b), sucrose뿐만 아니라 glucose와 maltose에서도 같은 결과가 나타내는 것이 보고된 바 있다(Shin 등, 1987a). 하지만 이러한 보고들과 다르게 본 연구에서는 오히려 sucrose의 함량을 5%에서 15%까지 높아졌음에도 불구하고 풀루란의 생산이 오히려 증가하는 반대의 결과가 나타났다. 또한 A. pullulans MR의 풀루란 생산에 있어 가장 큰 영향을 미친 초기 배지의 pH의 경우 A. pullulans 균주에 따라 최적 pH가 pH 3.8부터 pH 7.5까지 다양하게 나타나는 것을 알 수 있었는데(Singh 등, 2018a; Wang 등, 2013; Shin 등, 1991) A. pullulans MR의 경우 비교적 중성인 pH 7에서 가장 많은 양의 풀루란이 생산된 것을 알 수 있었다. 본 실험을 통해 A. pullulans MR의 풀루란 대량생산 가능성을 확인하였고, 이를 활용하여 식품, 화장품, 제약 등 여러 광범위한 분야에서 미생물 유래 다당류인 풀루란의 산업적 활용이 가능할 것이라 생각한다.

Abstract ▼ AI-Helper

Aureobasidium pullulans, a black yeast, produces pullulan, a linear α-glucan composed of maltotriose repeating units linked by α(1→6)-glycosidic linkages. Pullulan can be widely used in food, cosmetic, and biotechnology industries. In this study, we isolated eight strains of A. pullulans from Forsythia koreana, Magnolia kobus DC., Spiraea prunifolia var. simpliciflora, Cornus officinalis, Cerasus, and Hippophae rhamnoides. Among them, A. pullulans MR was selected as the best pullulan producer. The effects of a carbon source, a nitrogen source, and pH on pullulan production were examined. The optimal cultivation conditions for pullulan production by A. pullulans MR were determined by response surface methodology as 15% sucrose, 0.4% soy peptone, and an initial pH of 7 at 26℃. Under these conditions, the predicted pullulan production was 47.6 g/L, which was very close to the experimental data (48.9 g/L).

주제어

표/그림 (10)

표 Table 1. Viscosity of culture media grown with isolated A. pullulans strains
그림 Fig. 1. Pullulan production of 8 strains of Aureobasidium pullulans.
그림 Fig. 2. Pullulan and cell production of Aureobasidium pullulans MR by time.
그림 Fig. 3. Pullulan and cell production of Aureobasidium pullulans MR by temperature.
그림 Fig. 4. Pullulan production of Aureobasidium pullulans MR by carbon sources in media.
그림 Fig. 5. Pullulan production of Aureobasidium pullulans MR by nitrogen sources in media.
표 Table 2. Experimental design and result
표 Table 4. Effect Tests
표 Table 3. Analysis of variance (ANOVA)
그림 Fig. 6. 3D response surfaces and contours for pullulan production by Aureobasidium pullulans MR. (A) The interaction between sucrose and soy peptone, (B) The interaction between sucrose and initial PH, and (C) The interaction between soy peptone and initial pH.

AI 본문요약
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문제 정의

본 연구에서는 A. pullulans MR의 풀루란 생산에 있어 배양 조건에 따른 변화를 살펴보았다. 먼저 시간과 온도에 따른 건조된균체량과 풀루란 생산량의 변화를 비교하였으며, 기존의 AYS배지내 탄소원과 혼합질소원 변화에 따른 풀루란 생산량을 비교하였다.

제안 방법

4 정도로 적정한 뒤 살균하여 준비된 시료 10 g과 함께 으깨어준 후, 으깬 용액을 샘플로 하여 101 ~105 배 연속 희석한 후 YPD agar (BD Difco, Franklin Lakes, NJ, USA) 배지에 200 μL씩 도말하여 배양하였다. 30o C에서 3일간 배양 후 생성되는 단일 colony는 풀 루란 생성 배지로 알려진 AYS배지를 사용하여 28o C에서 3일간 배양하여 풀루란 생성 여부를 확인하였다. 풀루란 생성이 확인된 균주는 현미경으로 그 형태를 관찰하고 아래의 방법으로 ITS1- 5.
A. pullulans MR의 풀루란 생산에 대한 최적 조건을 알아보기 위해 JMP pro 13 software (SAS institute Inc., Seoul, Korea)의 Design of experiment (DOE) 방법 중 하나인 custom design을 이용하여 실험을 설계하고 결과에 따른 반응 표면 모델을 분석하였다. 풀루란의 생산(g/L)을 종속변수(Y)로 설정하고 예비실험을 통해 풀루란 생산에 영향을 주는 주요 요인인 sucrose (X1), soy peptone (X2), initial pH (X3)를 독립변수로 설정하였다.
A. pullulans MR의 풀루란 생산에 있어 최적 배양 시간을 알아보기 위해 AYS배지에서 배양 후 28 C, 200rpm에서 24시간 간격으로 8일 동안 배양 후 생성되는 풀루란을 비교하였다(Fig. 2). 그 결과 1일부터 5일까지 풀루란의 생산량이 계속해서 증가하여 5일에는 풀루란 생산량이 최대인 23.
8S rRNA-ITS2 영역을 증폭하였다. DNA 증폭을 위해 yeast universal primer인 ITS1 (5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3')와 ITS4 (5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3') primer을 이용하여 PCR을 수행하였다. PCRe Thermal cycler (ASTEC PC-320, ASTEC Inc, Fukuoka, Japan) 을 사용하여 95o C에서 10분간 pre-denaturation과정 후, 95o C에서 30초간 denaturation, 55o C에서 1분간 annealing, 72o C에서 30초간 extension의 과정을 30회 반복한 뒤 72o C에서 10분간 postextension을 수행하였다.
DNA 증폭을 위해 yeast universal primer인 ITS1 (5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3')와 ITS4 (5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3') primer을 이용하여 PCR을 수행하였다. PCRe Thermal cycler (ASTEC PC-320, ASTEC Inc, Fukuoka, Japan) 을 사용하여 95o C에서 10분간 pre-denaturation과정 후, 95o C에서 30초간 denaturation, 55o C에서 1분간 annealing, 72o C에서 30초간 extension의 과정을 30회 반복한 뒤 72o C에서 10분간 postextension을 수행하였다. 이후 생성된 PCR 산물은 0.
20 for Windows, Wyatt Technology Corporation, Santa Barbara, CA, USA)를 이용해서 계산했다. Pullulan 표준품 시리즈 P-5, P-10, P-20, P-100, P-200, P-400, P-800 (Shodex Standard Pullulan Kit P-82, Showa Denko)을 각각 0.2%의 농도로 3차 증류수에 용해시켜 상대 분자량 분석을 위한 표준곡선 작성에 사용하였다.
RSM을 이용한 배양 조건 최적화 실험을 하기에 앞서 기존의 AYS배지를 기본 배지로 하여 A. pullulans MR의 풀루란 생산을 위한 탄소원과 혼합질소원의 종류에 따른 영향을 알아보기 위해 예비 실험을 진행하였다. 풀루란 생산을 위한 배양 배지의 탄소 원으로는 sucrose, glucose, maltose, fructose, mannose, galactose, xylose, soluble starch 등의 사용이 보고된 바 있다(Sheng 등, 2016; Zajic과 LeDuy, 1977).
풀루란의 생산(g/L)을 종속변수(Y)로 설정하고 예비실험을 통해 풀루란 생산에 영향을 주는 주요 요인인 sucrose (X1), soy peptone (X2), initial pH (X3)를 독립변수로 설정하였다. 각각 독립변수의 범위는 2.5%≤X1≤20%, 0.01%≤X2≤0.4%, 2≤X3≤10 로 설정하였으며 독립변수의 각 범위에 대하여 26군의 실험조건을 설계하였다(Table 2).
그 후 4,000×g에서 10분간 원심분리하여 풀루 란 pellet을 얻었으며, 4o C에서 보관한 80% ethanol을 상층액 2배 량만큼 넣어준 후 원심분리(4,000×g, 10 min)하는 과정을 2번 반 복하여 pellet을 세척하였다. 그 후 80o C의 dry oven에서 20시간 이상 두어 ethanol을 제거하여 건조된 풀루란의 무게를 측정하였다.
pullulans MR을 선발하였다. 그 후 선발된 A. pullulans MR을 통한 풀루란 생산 시 필요되는 탄 소원, 질소원, pH, 온도 등과 같은 환경적인 요인에 의한 영향을 연구하였다. 더불어 일반적인 발효에 있어서 목적 물질을 생산할 때 종속변수의 최적화를 위한 실험계획법 중, 하나의 종속 변수에 다수의 독립변수들의 영향이 작용할 때 발생하는 중요 인자와 종속변수의 최대/최소화를 위한 독립변수의 최적조건을 알 수 있는 실험 방법(Kim 등, 2016; Ryu 등, 2019)인 response surface methodology (RSM)을 사용하여 배지 내 탄소원과 질소원의 농도와 초기 pH가 A.
pullulans MR을 통한 풀루란 생산 시 필요되는 탄 소원, 질소원, pH, 온도 등과 같은 환경적인 요인에 의한 영향을 연구하였다. 더불어 일반적인 발효에 있어서 목적 물질을 생산할 때 종속변수의 최적화를 위한 실험계획법 중, 하나의 종속 변수에 다수의 독립변수들의 영향이 작용할 때 발생하는 중요 인자와 종속변수의 최대/최소화를 위한 독립변수의 최적조건을 알 수 있는 실험 방법(Kim 등, 2016; Ryu 등, 2019)인 response surface methodology (RSM)을 사용하여 배지 내 탄소원과 질소원의 농도와 초기 pH가 A. pullulans MR의 풀루란 생산 수율에 미치는 영향에 대하여 심도있게 연구하였다. 본 연구를 통하여 최적 조건에서의 풀루란 생산이 가능할 것으로 사료되며 추후 식품소재로서 이용이 확대되고 있는 풀루란 소재의 효과적인 생산이 이루어질 것으로 판단한다.
pullulans 균주일지라도 풀루란 생산과 균체의 성장에 있어 각각의 최적 온도가 같지 않다는 McNeil 등(1990)의 연구결과와 일 치하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 A. pullulans MR의 풀루 란 생산을 위한 최적 배양 온도를 26o C로 정하여 이후 실험을 수행하였다.
pullulans의 풀루란 생산을 위한 최적 온도가 균주에 따라 26o C부터 30o C에 걸쳐 다양하게 나타난 것을 알 수 있다(Cheng 등, 2011a; Finkelman과 Vardanis,, 1982; Gibson 등, 2002; Jiang, 2010). 따라서 A. pullulans MR의 풀루란 생산에 있어서 최적 배양 온도를 알아보기 위해 AYS배지에 접 종 후 배양온도조건을 26, 28, 30o C로 다르게 설정하여 5일간 배 양한 뒤 각 온도별 풀루란의 생산량을 비교하였다(Fig. 3). A.
pullulans 균주들 가운데 가장 많은 풀루란 생성능을 일관성 있게 보여주었다. 따라서 풀루란 생산 최적화 실험을 위한 균주로 A. pullulans MR을 선발하여 추후 실험을 진행하였다.
풀루란의 생산에 영향을 미치는 효과적인 탄소원 과 질소원을 선정하기 위하여 기존 AYS 배지의 탄소원인 sucrose 를 glucose, fructose, galactose, maltose, lactose등으로 대체하여 비교 확인하였으며 질소원의 경우는 무기질소원으로 ammonium sulfate 대신에 sodium nitrate를 유기질소원으로 yeast extract 대신 에 beef extract, soy peptone 등으로 변경하여 실험을 진행하였다. 또한 RSM을 통한 배양 최적 실험에서 배지의 초기 pH 변화에 따른 결과를 알아보기 위하여 배지 초기 pH를 1 M HCl 과 1M NaOH을 사용하여 적정 후 실험하였다.
따라서 AYS배지의 최적 탄소원으로 sucrose, 혼합질소원으로 ammonium sulfate와 soy peptone의 조합을 선정하였다. 또한 예비 실험을 통해 선정된 배지 내 탄소원과 질소원의 농도에 따른 풀루란을 알아보기 위해 RSM의 독립변수로 sucrose와 soy peptone를 사용하였다.
pullulans MR의 풀루란 생산에 있어 배양 조건에 따른 변화를 살펴보았다. 먼저 시간과 온도에 따른 건조된균체량과 풀루란 생산량의 변화를 비교하였으며, 기존의 AYS배지내 탄소원과 혼합질소원 변화에 따른 풀루란 생산량을 비교하였다. 그 결과 sucrose와 ammonium sulfate, soy peptone을 본 실험의 최적 탄소원과 혼합질소원으로 결정하였으며, 그 후 반응표면분석법을 통해 탄소원인 sucrose와 질소원인 soy pepetone의 최적 농도와 최적 초기 pH를 알 수 있었다.
분리된 A. pullulans 균주들의 다당류 생산을 확인하기 위하여 AYS배지에 28o C, 200 rpm에서 배양 후 각각 3일과 5일 배양액의 점도를 측정하였다. 점도는 회전형 점도계(DV-II+ Pro, Brookfield Engineering Inc.
시료의 절대 분자량 분포 분석을 위해서는 고속크기 배제 크로마토그래피(high-performance size-exclusion chromatography, HPSEC) 시스템에 굴절률 검출기(refractive index detector, RI; RID-10A, Shimadzu, Kyoto, Japan)와 다각도 레이저선 산란 검출기(multiple laser light scattering detector, MALS; Dawn Heleos, Watt Technology Corporation, Santa Barbara, CA, USA)를 장착하여 사용했다. 분석용 컬럼으로는 Shodex OH pak SB-806 HQ와 SB- 804 HQ (8.
앞선 결과들을 토대로 A. pullulans MR의 풀루란 생산을 위한 배양 조건 최적화를 위하여 RSM을 수행하였다. JMP pro 13 software의 Custom design을 통한 실험 설계와 26개의 각 실험군에 따른 실험결과는 Table 2에 나타내었으며 회귀분석을 통한 실험 모델의 2차 회귀식은 다음과 같이 분석되었다.
PCRe Thermal cycler (ASTEC PC-320, ASTEC Inc, Fukuoka, Japan) 을 사용하여 95o C에서 10분간 pre-denaturation과정 후, 95o C에서 30초간 denaturation, 55o C에서 1분간 annealing, 72o C에서 30초간 extension의 과정을 30회 반복한 뒤 72o C에서 10분간 postextension을 수행하였다. 이후 생성된 PCR 산물은 0.8% agarose gel 전기영동 후 정제하여 Macrogen Co. (Seoul, Korea)에 의뢰하여 염기서열을 분석하였으며 분석된 염기서열은 National Center Biotechnology Information (NCBI)의 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)을 이용하여 동정하였다.
pullulans가 유일하게 발견되었다. 최종적으로 8개의 A. pulllulans 균주를 분리하였으며, 분리된 균주 중 풀루란 생산능력이 가장 뛰어난 균주를 선발하기 위해 AYS배지에 접종하여 28 C, 200rpm에서 각각 3일과 5일 배양 후 배양액의 점도를 측정하여 생산된 다당체의 양을 간접적으로 확인하였다(Table 1). 더불어 생산된 다당체를 배양액으로부터 분리하여 농축하고 α-glucosidic 결합을 잘라주는 pullulanase로 분해하여 maltotriose가 생성됨을 확인하였다.
30o C에서 3일간 배양 후 생성되는 단일 colony는 풀 루란 생성 배지로 알려진 AYS배지를 사용하여 28o C에서 3일간 배양하여 풀루란 생성 여부를 확인하였다. 풀루란 생성이 확인된 균주는 현미경으로 그 형태를 관찰하고 아래의 방법으로 ITS1- 5.8S rRNA-ITS2 영역의 염기서열을 확인하여 동정을 하였다 (Kurtzman 등, 2003).
, Seoul, Korea)의 Design of experiment (DOE) 방법 중 하나인 custom design을 이용하여 실험을 설계하고 결과에 따른 반응 표면 모델을 분석하였다. 풀루란의 생산(g/L)을 종속변수(Y)로 설정하고 예비실험을 통해 풀루란 생산에 영향을 주는 주요 요인인 sucrose (X1), soy peptone (X2), initial pH (X3)를 독립변수로 설정하였다. 각각 독립변수의 범위는 2.
5일때 배양액 500 μL를 채취하여 AYS 배지 50 mL에 접종한 뒤 28o C, 200 rpm에서 3일 간 배양하였다. 풀루란의 생산에 영향을 미치는 효과적인 탄소원 과 질소원을 선정하기 위하여 기존 AYS 배지의 탄소원인 sucrose 를 glucose, fructose, galactose, maltose, lactose등으로 대체하여 비교 확인하였으며 질소원의 경우는 무기질소원으로 ammonium sulfate 대신에 sodium nitrate를 유기질소원으로 yeast extract 대신 에 beef extract, soy peptone 등으로 변경하여 실험을 진행하였다. 또한 RSM을 통한 배양 최적 실험에서 배지의 초기 pH 변화에 따른 결과를 알아보기 위하여 배지 초기 pH를 1 M HCl 과 1M NaOH을 사용하여 적정 후 실험하였다.

대상 데이터

5). 따라서 AYS배지의 최적 탄소원으로 sucrose, 혼합질소원으로 ammonium sulfate와 soy peptone의 조합을 선정하였다. 또한 예비 실험을 통해 선정된 배지 내 탄소원과 질소원의 농도에 따른 풀루란을 알아보기 위해 RSM의 독립변수로 sucrose와 soy peptone를 사용하였다.
1% (w/v)로 구성이 되어 있다(Shin 등, 1989). 또한 일반적인 균주의 배양은 YPD 배지(yeast extract 0.1%, peptone 0.2%, dextrose 0.2%, agar 1.5%)를 사용하였다.
pullulans MRe YPD agar 배지에 배양된 채로 4o C에 보관하였으며 전 배양을 위해 YPD broth 10 mL에 한 백금이 접종하여 28o C, 200 rpm에서 3일간 배양하였다. 본 배양을 위해 O.D. (optical density)를 측정하여 O.D.값이 2.5일때 배양액 500 μL를 채취하여 AYS 배지 50 mL에 접종한 뒤 28o C, 200 rpm에서 3일 간 배양하였다. 풀루란의 생산에 영향을 미치는 효과적인 탄소원 과 질소원을 선정하기 위하여 기존 AYS 배지의 탄소원인 sucrose 를 glucose, fructose, galactose, maltose, lactose등으로 대체하여 비교 확인하였으며 질소원의 경우는 무기질소원으로 ammonium sulfate 대신에 sodium nitrate를 유기질소원으로 yeast extract 대신 에 beef extract, soy peptone 등으로 변경하여 실험을 진행하였다.
본 실험에 사용한 탄소원 기질인 sucrose는 Duchefa (Seoul, Korea), D-(−)-fructose, D(+)-galactose, lactose monohydrate는 Daejung (Siheung, Korea), glucose는 Duksan (Ansan, Korea), D(+)-maltose는 Yakuri Pure Chemicals Co. (Kyoto, Japan) 에서구매하여 사용하였다. 질소원 기질인 ammonium sulfate는 Daejung (Siheung, Korea), sodium nitrate는 Hanawa Pure Chemical Ind.
본 실험에서 풀루란을 생산하는 미생물을 스크리닝하기 위하여 사용한 배지는 AYS배지이다. 이 배지의 성분은 sucrose 5%, K²HPO⁴ 0.
본 실험에서는 sucrose 외에 단당류와 이당류인 glucose, fructose, galactose, maltose, lactose를 기질로 사용하였으며, 혼합질소원의 경우 무기질소원인 ammonium sulfate, sodium nitrate와 유기질소 원인 yeast extract, beef extract, soy peptone을 조합하여 26 C에서 5일간 배양 후 최적 탄소원과 질소원 조합을 선정하였다. 먼저 탄소원의 경우 기존 AYS배지의 기본 탄소원인 sucrose 을 사용하였을 때 23.
본 연구에서는 국내에서 자생하는 식물을 분리원으로 하여 풀루란을 생산하는 미생물을 스크리닝하였고 그 중 가장 많은 풀루란을 생산하는 균주로 A. pullulans MR을 선발하였다. 그 후 선발된 A.
분석용 컬럼으로는 Shodex OH pak SB-806 HQ와 SB- 804 HQ (8.0mm ID 300mm, Showa Denko, Tokyo, Japan)을 연결하여 컬럼 오븐의 온도를 55 C로 유지해서 사용했다. 분자량과 크기 분포는 Astra software (Version 5.
시료는 국내 전라북도 전주시 덕진구와 완주군, 전라북도 정읍 시 산외면, 대전광역시 유성구, 경상북도 경주시에서 2019년에 채 취한 개나리(Forsythia koreana), 목련(Magnolia kobus DC.), 조팝 나무(Spiraea prunifolia var. simpliciflora), 산수유(Cornus officinalis), 벚나무(Cerasus)와 2017년에 강원도 화천에서 채취한 비타민나무 (Hippophae rhamnoides)의 꽃과 열매를 사용하였다. NaCl (0.
(Osaka, Japan)에서 구매하고 yeast extract와 soy peptone는 BD Difco (Franklin Lakes, NJ, USA), beef extract는 MB cell (Seoul, Korea)에서 구매하여 사용하였다. 풀루란 생성 확인을 위해 제작한 AYS배지(Shin 등, 1989)의 조성으로 사용된 magnesium sulfate heptahydrate는 Daejung (Siheung, Korea), sodium chloride 는 Samchun Chemicals (Pyeongtaek, Korea), potassium phosphate 는 Bioneer Corp. (Deajeon, Korea)에서 구매하였으며 풀루란의 침전을 위해 사용된 ethyl alcohol anhydrous, 99.9%는 Daejung (Siheung, Korea)에서 구매하였다.

이론/모형

수 있었다. 분리된 효모들은 각각의 ITS1-5.8S rRNA-ITS2 영역을 증폭하여 얻어진 PCR 산물의 염기서열을 BLAST sequence analysis tool (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)을 이용하여 분석 후 동정하였다. 특히 Filobasidium magnum, Cryptococcus tephrensis, C.
생산된 풀루란의 평균분자량은 고속크기배제크로마토그래피 시스템을 이용하여 측정하였다. 결과적으로 약 1.
풀루란의 분리 및 정량은 기존에 Singh 등(2009a)에서 보고된 방법을 참고하여 수행하였다. 배양액 5 mL를 10,000×g에서 5분 간 원심분리하여 균체를 제거하고, 풀루란 침전을 위해 상층액 3 배량의 −70o C에서 보관한 99% ethanol을 처리하여 −70o C에서 30 분간 침전하였다.

성능/효과

3). A. pullulans MR의 경우 26o C에서 배양하였을 때 27.6±0.57 g/L로 가장 높은 풀루란 생산량을 보였으며 28o C일때 25.1±0.99 g/L, 30o C 일때 생산량이 급격하게 줄어서 10.1±0.99 g/L의 풀루란이 생산되는 것을 알 수 있었다. 반면에 A.
결과적으로 A. pullulans MR을 26 C에서 5일간 배양할 경우 반응표면분석법을 이용하여 얻은 최적 배양 조건은 sucrose 15%, soy peptone 0.4%, 초기 pH 7이였으며, 위의 배양 조건에서 예측할 수 있는 풀루란의 최대생산량은 47.6 g/L이었다. 이후 확인 실험을 위해 A.
28g/L에 도달하였다. 균주의 성장을 건조균체량으로 측정하여 살펴본 결과 건조된 균체량 역시 5일차까지 6.0±0.57g/L로 점차 증가하는 모습을 보이다가 그 이후로 균체량이 더 증가하지 않는 양상을 띄었다. 이는 A.
2). 그 결과 1일부터 5일까지 풀루란의 생산량이 계속해서 증가하여 5일에는 풀루란 생산량이 최대인 23.4±0.28g/L에 도달하였다. 균주의 성장을 건조균체량으로 측정하여 살펴본 결과 건조된 균체량 역시 5일차까지 6.
먼저 시간과 온도에 따른 건조된균체량과 풀루란 생산량의 변화를 비교하였으며, 기존의 AYS배지내 탄소원과 혼합질소원 변화에 따른 풀루란 생산량을 비교하였다. 그 결과 sucrose와 ammonium sulfate, soy peptone을 본 실험의 최적 탄소원과 혼합질소원으로 결정하였으며, 그 후 반응표면분석법을 통해 탄소원인 sucrose와 질소원인 soy pepetone의 최적 농도와 최적 초기 pH를 알 수 있었다. 분산분석 결과를 토대로 비교하였을 때 A.
4). 그리고 질소원의 경우 ammonium sulfate와 soy peptone의 조합이 18.4±0.28 g/L로 sodium nitrate와 soy peptone의 조합보다 0.4g/L 더 근소하게 많은 풀루란이 생성되며, 유기질소원으로 soy peptone을 사용할 경우 무기질 소원의 종류에 관계없이 풀루란의 생산량이 가장 높은 것을 확인하였다 (Fig. 5). 따라서 AYS배지의 최적 탄소원으로 sucrose, 혼합질소원으로 ammonium sulfate와 soy peptone의 조합을 선정하였다.
28 g/L로 관찰되었다. 낮은 온도인 26o C에서 균체의 양이 20% 정도 적게 생성되나 풀루란의 생산은 오히려 9% 이상 증가하는 결과가 매우 흥미롭게 보였다. 하지만 오히려 30o C 에서는 균체의 양이 줄어들었음에도 불구하고 급격하게 풀루란 의 생산이 낮아짐을 확인할 수 있었다.
pulllulans 균주를 분리하였으며, 분리된 균주 중 풀루란 생산능력이 가장 뛰어난 균주를 선발하기 위해 AYS배지에 접종하여 28 C, 200rpm에서 각각 3일과 5일 배양 후 배양액의 점도를 측정하여 생산된 다당체의 양을 간접적으로 확인하였다(Table 1). 더불어 생산된 다당체를 배양액으로부터 분리하여 농축하고 α-glucosidic 결합을 잘라주는 pullulanase로 분해하여 maltotriose가 생성됨을 확인하였다. 이는 분리된 균주로부터 생산되는 다당체가 풀루란임을확인한 것이다.
그 결과 sucrose와 ammonium sulfate, soy peptone을 본 실험의 최적 탄소원과 혼합질소원으로 결정하였으며, 그 후 반응표면분석법을 통해 탄소원인 sucrose와 질소원인 soy pepetone의 최적 농도와 최적 초기 pH를 알 수 있었다. 분산분석 결과를 토대로 비교하였을 때 A. pullulans MR의 풀루란 생산에 있어 세가지 변수 중 특히 초기 pH가 풀루란 생산에 가장 큰 영향을 미친다는 것을 확인하였다.
실험을 위해 채취한 꽃과 열매 시료에서 다양한 종류의 효모를 분리할 수 있었다. 분리된 효모들은 각각의 ITS1-5.
4%, initial pH 7로 분석되었다. 위의 조건에서 A. pullulans MR의 풀루란 최대 생산 예측 값은 47.6 g/L였으며 확인 실험을 통해 얻은 풀루란 값은 48.9±3.4 g/ L로 예측된 풀루란 생산량과 매우 근접한 값을 얻을 수 있었다.
하지만 오히려 30o C 에서는 균체의 양이 줄어들었음에도 불구하고 급격하게 풀루란 의 생산이 낮아짐을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 동일한 A. pullulans 균주일지라도 풀루란 생산과 균체의 성장에 있어 각각의 최적 온도가 같지 않다는 McNeil 등(1990)의 연구결과와 일 치하는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 A.
이처럼 RSM 분석 방법을 효과적으로 활용하여 A. pullulans MR 균주에서의 풀루란 생산 조건을 최적화 할 수 있었고, 예측된 값과 매우 유사한 값을 실험을 통하여 얻어낼 수 있었으며 이를 풀루란 생산을 위한 최적화 공정에 이용할 수 있을 것으로 판단하였다.
6 g/L이었다. 이후 확인 실험을 위해 A. pullulans MR을 동일 조건으로 배양한 뒤 풀루란의 생산량을 관찰한 결과 48.9±3.4 g/L로 예측된 값과 근접한 값을 얻을 수 있었다.
6에 나타내었다. 최종적으로 maximizing desirability를 통해 풀루란 생산의 최적점을 찾았으며, 최대의 풀루란을 생산하기 위한 세가지 종속 변수의 최적 조건은 sucrose 15%, soy peptone 0.4%, initial pH 7로 분석되었다. 위의 조건에서 A.
pullulans MR만이 10g/L 이상의 풀루란을 생산하는 것으로 확인이 되었다. 특히 A. pullulans MR의 경우 3일과 5일 배양 후의 풀루란 생산량은 각각 20.4, 24.1g/L로 8개의 A. pullulans 균주들 가운데 가장 많은 풀루란 생성능을 일관성 있게 보여주었다. 따라서 풀루란 생산 최적화 실험을 위한 균주로 A.
gov/BLAST/)을 이용하여 분석 후 동정하였다. 특히 Filobasidium magnum, Cryptococcus tephrensis, C. aureus, Pseudomicrostroma glucosiphilum, Papiliotrema flavescens 와 같은 효모를 분리하였으며 분리된 균주 중 풀루란을 생성하는 균주로는 A. pullulans가 유일하게 발견되었다. 최종적으로 8개의 A.
이는 배지내 sucrose의 함량이 높아 질수록 sucrose의 농도에 의한 삼투압 현상과 낮은 수분활성도로 인해 발생하며(Singh 등, 2009b), sucrose뿐만 아니라 glucose와 maltose에서도 같은 결과가 나타내는 것이 보고된 바 있다(Shin 등, 1987a). 하지만 이러한 보고들과 다르게 본 연구에서는 오히려 sucrose의 함량을 5%에서 15% 까지 높아졌음에도 불구하고 풀루란의 생산이 오히려 증가하는 반대의 결과가 나타났다. 또한 A.

후속연구

본 실험을 통해 A. pullulans MR의 풀루란 대량생산 가능성을 확인하였고, 이를 활용하여 식품, 화장품, 제약 등 여러 광범위한 분야에서 미생물 유래 다당류인 풀루란의 산업적 활용이 가능할 것이라 생각한다.
pullulans MR의 풀루란 생산 수율에 미치는 영향에 대하여 심도있게 연구하였다. 본 연구를 통하여 최적 조건에서의 풀루란 생산이 가능할 것으로 사료되며 추후 식품소재로서 이용이 확대되고 있는 풀루란 소재의 효과적인 생산이 이루어질 것으로 판단한다.
pullulans HP- 2001를 이용한 풀루란의 생산 실험에서 균주의 성장이 40시간 후 멈추고 정지기에 들어가지만 풀루란의 생산은 72시간까지 지속적으로 증가한다는 실험과는 약간 상이한 결과가 나타났다. 하지만 이는 플라스크 배양과 회분식 발효조에서의 조건 차이에 의한 결과에서 기인한 것으로 보여지며 특히 A. pullulans의 배양 형태와 풀루란의 생산이 밀접한 관계가 있다는 보고들이 있는 바발효 조건에 따른 균주의 형태에 대한 연구가 추후 필요할 것으로 생각된다(Son 등, 2006).

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저자의 다른 논문 :

표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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