농부산물을 이용한 고체발효에서 발효조건이 목질계 분해 효소 생산에 미치는 영향 Effects of Fermentation Parameters on Cellulolytic Enzyme Production under Solid Substrate Fermentation원문보기
목질계 분해효소 활성 증대를 위해 밀짚을 이용한 고체발효에서 주요 발효인자의 최적화를 수행하였다. Trichoderma reesei와 Aspergillus niger를 이용한 혼합배양에서 고체발효에 주요한 영향을 미친다고 알려진 배양온도, pH, 수분함량과 고체기질 크기를 순차적 최적화를 진행하였다. 실험에 적용 된 인자 모두 목질계 분해효소 활성에 유의한 효과를 주었으며, 발효온도 $40^{\circ}C$, pH 7, 수분함량 75%와 고체기질 크기 0.25~0.5 mm가 목질계 분해효소 생산을 위한 최적 조건임을 알 수 있었다. 최적조건 하에서 밀짚을 이용한 고체발효를 수행하였을 때, 효소활성 기준 cellulase 10.3 IU, endoglucanase 100.3 IU, ${\beta}$-glucosidase 22.9 IU와 xylanase 2261.7 IU/g dry material을 배양 96시간에 확인할 수 있었다. 본 결과는 기존 효소활성 대비 각각 72.6, 48.7, 55.2와 51.9% 증가한 수치로 혼합배양과 순차적 최적화를 적용하여 효과적인 목질계 분해효소 활성 증대가 가능함을 확인하였다.
목질계 분해효소 활성 증대를 위해 밀짚을 이용한 고체발효에서 주요 발효인자의 최적화를 수행하였다. Trichoderma reesei와 Aspergillus niger를 이용한 혼합배양에서 고체발효에 주요한 영향을 미친다고 알려진 배양온도, pH, 수분함량과 고체기질 크기를 순차적 최적화를 진행하였다. 실험에 적용 된 인자 모두 목질계 분해효소 활성에 유의한 효과를 주었으며, 발효온도 $40^{\circ}C$, pH 7, 수분함량 75%와 고체기질 크기 0.25~0.5 mm가 목질계 분해효소 생산을 위한 최적 조건임을 알 수 있었다. 최적조건 하에서 밀짚을 이용한 고체발효를 수행하였을 때, 효소활성 기준 cellulase 10.3 IU, endoglucanase 100.3 IU, ${\beta}$-glucosidase 22.9 IU와 xylanase 2261.7 IU/g dry material을 배양 96시간에 확인할 수 있었다. 본 결과는 기존 효소활성 대비 각각 72.6, 48.7, 55.2와 51.9% 증가한 수치로 혼합배양과 순차적 최적화를 적용하여 효과적인 목질계 분해효소 활성 증대가 가능함을 확인하였다.
The present study was carried out to optimize fermentation parameters for the production of cellulolytic enzymes through solid substrate fermentation of Trichoderma reesei and Aspergillus niger grown on wheat straw. A sequential optimization based on one-factor-at-a-time method was applied to optimi...
The present study was carried out to optimize fermentation parameters for the production of cellulolytic enzymes through solid substrate fermentation of Trichoderma reesei and Aspergillus niger grown on wheat straw. A sequential optimization based on one-factor-at-a-time method was applied to optimize fermentation parameters including temperature, pH, moisture content and particle size. The results of optimization indicated that $40^{\circ}C$, pH 7, moisture content 75% and particle size between 0.25~0.5 mm were found to be the optimum condition at 96 hr fermentation. Under the optimal condition, co-culture of T. reesei and A. niger produced cellulase activities of 10.3 IU, endoglucanase activity of 100.3 IU, ${\beta}$-glucosidase activity of 22.9 IU and xylanase activity of 2261.7 IU/g dry material were obtained. Cellulolytic enzyme production with optimization showed about 72.6, 48.8, 55.2 and 51.9% increase compared to those obtained from control experiment, respectively.
The present study was carried out to optimize fermentation parameters for the production of cellulolytic enzymes through solid substrate fermentation of Trichoderma reesei and Aspergillus niger grown on wheat straw. A sequential optimization based on one-factor-at-a-time method was applied to optimize fermentation parameters including temperature, pH, moisture content and particle size. The results of optimization indicated that $40^{\circ}C$, pH 7, moisture content 75% and particle size between 0.25~0.5 mm were found to be the optimum condition at 96 hr fermentation. Under the optimal condition, co-culture of T. reesei and A. niger produced cellulase activities of 10.3 IU, endoglucanase activity of 100.3 IU, ${\beta}$-glucosidase activity of 22.9 IU and xylanase activity of 2261.7 IU/g dry material were obtained. Cellulolytic enzyme production with optimization showed about 72.6, 48.8, 55.2 and 51.9% increase compared to those obtained from control experiment, respectively.
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문제 정의
본 실험의 목적은 대표적인 농부산물인 밀짚을 고체기질로 활용하여 T. reesei와 A. niger의 혼합배양을 통한 목질계 분해효소 활성 증대를 위한 발효조건 최적화에 있다. 통계학적 최적화를 활용하여 기존에 목질계 효소생산에 주요한 효과를 준다고 알려진 배양온도, pH와 수분함량을 최적화하여 cellulase, endoglucanase, β-glucosidase와xylanase 최대 생산 조건을 탐색하고자 하였다.
통계학적 최적화를 활용하여 기존에 목질계 효소생산에 주요한 효과를 준다고 알려진 배양온도, pH와 수분함량을 최적화하여 cellulase, endoglucanase, β-glucosidase와xylanase 최대 생산 조건을 탐색하고자 하였다.
제안 방법
효소용액으로부터 cellulase 활성 분석을 위해 Whatman #1 filter paper를 기질로 이용한 FPA (filter paper activity) 표준 측정을 수행하였다. Endoglucanase 활성 측정은 1% carboymethyl cellulose (CMC)를 기질로 이용하여 측정하였다. β-glucosidase 활성은 1% pNPG 용액을 이용하여 0.
고체배양에서 기질로 사용된 밀짚의 초기 수분함량이 목질계 분해효소 활성에 미치는 영향을 평가하기 위해 고체배지에 멸균 증류수 혼합량을 조절하여 수분함량 69~85% 조건에서 효소생산 실험을 수행하였다. Fig.
고체배양에서 발효온도와 함께 초기 pH는 유기산 및 효소생산에 중요한 변수로 알려져 있으며, 본 실험서 발효온도 40 °C, 수분함량 70%, 입자크기 2.0 mm 이하를 기준조건으로 고체배지의 초기 산도를 완충용액 첨가를 통해 pH 4~8 범위로 조절하여 효소생산을 비교하였다[18,19].
목질계 분해효소 활성에 미치는 배양온도의 영향을 비교하기 위해 발효조건 pH 6, 수분함량 70%와 혼합 고체배지(입자크기 2.0 mm 이하)를 기본조건으로 발효온도를 변화시켜(25~60 °C) 효소생산을 비교하였다.
고체기질 입자크기는 고체배양 중 통기율, 가스교환, 열전달, 수분함유량 및 미생물 고정에 영향을 주는 인자로 알려져 있다[25]. 목질계 분해효소 활성에 미치는 파쇄밀짚의 입자크기의 영향을 파악하기 위해 입자크기 0.15~4.0 mm 범위에서 96시간 발효를 진행하였다. Fig.
효소용액으로부터 cellulase 활성 분석을 위해 Whatman #1 filter paper를 기질로 이용한 FPA (filter paper activity) 표준 측정을 수행하였다. Endoglucanase 활성 측정은 1% carboymethyl cellulose (CMC)를 기질로 이용하여 측정하였다.
대상 데이터
Trichoderma reesei ATCC 56765과 Aspergillus niger ATCC 10864는American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA)에서 분양 받아 사용하였다. 포자(spore) 생산을 위해 고체배지인 potato dextrose agar plates (Sigma, St.
고체발효 실험을 위해 McGill 대학 농장으로부터 밀짚을 제공받아 영양성분을 첨가하여 고체기질로 사용하였다. 밀짚의 구성성분은 NREL 표준분석방법 001~004을 사용하여 분석하였다.
밀짚의 구성성분은 NREL 표준분석방법 001~004을 사용하여 분석하였다. 본 실험에 사용 된 밀짚의 성분은 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스, 리그닌의 함량은 각각 36.2, 23.0, 18.2%로 분석되었다 [15]. 고체기질에 첨가된 영양 성분은 농축액(x20)으로 제조하여 증류수와 혼합하여 고체기질에 첨가하였다.
이론/모형
β-glucosidase 활성은 1% pNPG 용액을 이용하여 0.05 M acetate buffer (pH 4.6)에서 효소용액 0.5 mL과 혼합하여 생산된 단당을 DNS법을 이용한 발색법으로 정량하였다[16,17].
고체발효 실험을 위해 McGill 대학 농장으로부터 밀짚을 제공받아 영양성분을 첨가하여 고체기질로 사용하였다. 밀짚의 구성성분은 NREL 표준분석방법 001~004을 사용하여 분석하였다. 본 실험에 사용 된 밀짚의 성분은 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스, 리그닌의 함량은 각각 36.
성능/효과
5). 4개의 주요한 영향인자를 순차적 최적화하였을 때, 최적화 이전 수준인 5.9, 67.4, 14.8와 1488.8 IU/g DM에 비해 효소활성이 51~73% 증가함을 확인할 수 있었다.
고체배양에서 기질로 사용된 밀짚의 초기 수분함량이 목질계 분해효소 활성에 미치는 영향을 평가하기 위해 고체배지에 멸균 증류수 혼합량을 조절하여 수분함량 69~85% 조건에서 효소생산 실험을 수행하였다. Fig. 3의 결과와 같이 밀짚의 초기 수분함량이 효소생산에 유의한 영향을 미치며, 수분함량 75%에서 최대 효소생산을 확인할 수 있었던 반면, 70% 이하의 수분함량에서 효소생산이 크게 감소함을 알 수 있었다. 특히, 수분함량 50% 이하의 경우 효소 생산이 크게 감소해 4.
0 mm 범위에서 96시간 발효를 진행하였다. Fig. 4에서 보는 바와 같이 입자크기 0.25~0.5 mm 범위에서 최대 효소생산인 11.2, 102.2, 21.3과 2239.3 IU/g SM을 얻을 수 있었으며 입자크기 증가 또는 감소에 따라 효소생산이 급격하게 감소함을 확인할 수 있었다. 기존의 연구에 따르면 고체발효에 적합한 입자크기는 0.
바이오연료 생산에 있어 가격 경쟁력 있는 효소생산이 상업화 공정개발의 핵심 요소로 대두됨에 따라, 기존의 액체발효가 아닌 농부산물을 이용한 고체발효법이 친환경적이고 경제적인 대안으로 주목을 받고 있다. 기존 실험에서 T. reesei와 A. niger의 혼합배양을 적용하였을 때, 목질계 효소 간 상승작용에 의해 각 균주의 단일배양에 비해 효소 생산이 증가함을 확인할 수 있었다. 이에 대한 후속 연구로 밀짚에서 혼합배양을 이용한 목질계 효소 생산 증진을 위해 주요발효조건인 온도, pH, 수분함량과 파쇄볏짚 크기를 순차적으로 최적화하여 효소 생산을 효과적으로 증진시킬 수 있었다.
이는 배양온도 증가에 따라, 열전도도가 낮은 고체배지의 내부 온도상승으로 TCA 회로 관련 효소들이 고온에서 활성저하가 발생하여 세포성장이 저하되고 그에 따른 목적산물 생산이 감소하는 것으로 예상할 수 있다. 또한, 고온에서 수분 증발량이 증가함에 따라 발효 후반부의 최적 수분함량인 70~80% 대비 낮은 수분함량을 가짐에 따라 균사체의 성장보다는 포자 생성향으로 성장주기를 전환되어 효소생산이 감소했다고 결론지을 수 있다. 최적 조건 적용 시, 기준 배양조건인 30 °C에서 진행된 고체발효 실험 대비 목질계 효소 생산이 각각 48.
목질계 효소 생산에 있어 발효에서 최적발효 온도는 40 °C에서 형성이 되었으며 cellulase 9.1 IU, endoglucanase 86.9 IU, β-glucosidase 19.1 IU와 xylanase 2073.1 IU/g dry material (DM)를 얻을 수 있었다(Fig. 1).
1 mm이하의 입자크기에서는 공극감소, 통기율 감소와 막힘(clogging) 현상발생에 따라 효소생산이 감소된다고 알려져 있다. 본 실험을 통해 수분함량 최적화로 기준배양 조건 대비 목질계 효소 생산이 2~21% 증가된 결과를 얻을 수 있었다.
niger의 혼합배양을 적용하였을 때, 목질계 효소 간 상승작용에 의해 각 균주의 단일배양에 비해 효소 생산이 증가함을 확인할 수 있었다. 이에 대한 후속 연구로 밀짚에서 혼합배양을 이용한 목질계 효소 생산 증진을 위해 주요발효조건인 온도, pH, 수분함량과 파쇄볏짚 크기를 순차적으로 최적화하여 효소 생산을 효과적으로 증진시킬 수 있었다. 효소생산 검증실험에서, cellulase 10.
최적 조건 적용 시, 기준 배양조건인 30 °C에서 진행된 고체발효 실험 대비 목질계 효소 생산이 각각 48.6, 14.6, 24.3과 19.9% 증가된 결과이다.
1). 최적온도 이상이었던 50℃에서는 효소생산이 감소함을 확인할 수 있었다. 이는 배양온도 증가에 따라, 열전도도가 낮은 고체배지의 내부 온도상승으로 TCA 회로 관련 효소들이 고온에서 활성저하가 발생하여 세포성장이 저하되고 그에 따른 목적산물 생산이 감소하는 것으로 예상할 수 있다.
고체발효법은 잉여수분이 최소화된 고체의 표면에서 미생물을 배양하는 전통적인 발효방법으로 아시아를 중심으로 발효식품 생산에 널리 사용되고 있다. 특히 곰팡이 균과 같은 부착 성장형 미생물을이용한 유기산 및 효소 생산에 유리한 배양공정으로 발효에 사용되는 고체기질은 고착 표면뿐만 아니라 탄소원 및 질소원으로 사용된다[10,11].
제1세대 전환기술의 단점 극복을 위해 무엇에 관심이 증가되고 있는가?
제1세대 전환기술의 단점 극복을 위해 비식용 바이오매스를 이용한 바이오연료 개발에 관심이 증가하고 있다. 특히, 목질계 농부산물을 이용한 제2세대 전환기술 개발이 활발하게 연구되고 있다.
고체발효법이 고착 표면뿐만 아니라 탄소원 및 질소원으로 사용될 수 있는 이유는?
고체발효법은 잉여수분이 최소화된 고체의 표면에서 미생물을 배양하는 전통적인 발효방법으로 아시아를 중심으로 발효식품 생산에 널리 사용되고 있다. 특히 곰팡이 균과 같은 부착 성장형 미생물을이용한 유기산 및 효소 생산에 유리한 배양공정으로 발효에 사용되는 고체기질은 고착 표면뿐만 아니라 탄소원 및 질소원으로 사용된다[10,11]. 고체발효는 다양한 고체기질을 활용할 수 있으며 볏짚, 밀짚, 옥수수대, 감자 껍질, 오렌지 껍질 및 맥주 생산 부산물(spent brewers grains)을 포함한 농/산업부산물이 널리 사용되고 있다.
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