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문제 정의
- 따라서, 본 연구에서는 메밀 새싹을 기능성 소재로서 개발하기 위하여 메밀 새싹의 유용성분의 최적추출을 확립하고자 하였으며, 이를 위하여 메밀 새싹채소의 총페놀함량, α-glucosidase 저해능, ACE 저해능에 대한 추출특성을 반응 표면분석에 의해 모니터링하고자 하였다.
제안 방법
- 식물에 널리 분포되어 있는 페놀성 물질은 phenolic hydroxyl 그룹 때문에 단백질 또는 효소단백질, 기타 거대분자들과 결합하는 성질, 항산화 효과, 2가 금속이온과의 결합력을 가진다(20). 따라서 본 실험에서는 메밀 새싹에 존재하는 총 폴리페놀 함량에 대하여 기준물질로 측정 비교하였다. 중심합성계획에 의한 메밀새싹 추출조건별 총페놀성 화합물 함량은 Table 3에서와 같이 107.
- 최적 추출조건은 반응변수인 추출물의 특성 즉, 수율, 총페놀성 화합물 함량, α-glucosidase 저해활성 및 ACE 저해 활성의 반응표면을 superimposing했을 때 중복되는 부분의 범위로 예측하였다. 또한 예측된 범위에서 임의의 점을 설정하여 회귀식에 대입한 후 그 예측된 최적값들에 대하여 검증을 실시하였다.
- 메밀 새싹을 이용한 가공소재로의 활용성을 높이고 기능성 물질의 최적 추출 조건을 유도하고자 중심합성계획에 의한 20구간의 추출조건에 따라 추출시험을 실시하였다. 이때 얻어진 각각의 추출물에 대하여 수율, 총페놀성 화합물 함량, α-glucosidase 저해활성 및 ACE 저해활성을 측정한 결과를 Table 3에 나타내었다.
- 메밀 새싹의 유용성분의 추출조건을 설정하기 위하여 추출조건별 추출물의 수율, 총페놀성 화합물 함량, α-glucosidase 저해활성능 및 ACE 저해활성능에 대한 추출 특성을 조사하였다.
- 본 실험에 사용된 메밀은 강원도 봉평에서 2008년에 재배된 종자를 구입한 것을 사용하였다. 메밀 종자는 4시간 침수 시킨 뒤 건전한 것을 선별한 후 1일 4회 15분간 분주하도록 설정한 새싹재배기(Mikrofarm, EasyGreen Co., MA, USA)을 이용하여 7일간 18℃에서 성장시켰다. 메밀새싹은뿌리부분을 제외한 줄기이상의 부분을 절단한 즉시 -70℃의 온도에서 동결하였다.
- 본 실험은 메밀새싹의 추출조건에 따른 수율, 총 페놀, α-glucosidase 저해활성능, 및 ACE 저해활성능에 대해 반응 표면 분석법을 이용하여 추출조건을 최적화하였다.
- 25 mL를 가하여 15초간 교반한 후 3,000×g에서 5분간 원심분리 하여 상징액 1 mL를 취하였다. 이 상징액을 완전히 건조 시킨 뒤 1 N NaCl 1.5 mL를 가하여 용해한 다음 분광광도계(V-570, Jasco Co., Tokyo, Japan)를 이용하여 228 nm에서 흡광도를 측정하여 ACE 저해 활성을 구하였다. 모든 실험은 3회 반복 실험하였으며, ACE 저해활성도는 아래의 식에따라 계산하였다.
- 최적 추출조건은 반응변수인 추출물의 특성 즉, 수율, 총페놀성 화합물 함량, α-glucosidase 저해활성 및 ACE 저해 활성의 반응표면을 superimposing했을 때 중복되는 부분의 범위로 예측하였다.
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추출
추출조건 설정을 위한 추출물의 추출방법은 시료 10 g을 취하여 각각 조건별로 가수한 다음, 환류냉각장치로 추출 온도와 추출시간을 달리하면서 추출한 후 100 mL로 정용하여 여과지(Watman No. 2)를 사용하여 감압 여과한 것을 추출물의 품질인자 측정에 사용하였으며, 각 조건별로 3회 반복 추출하였다.
- 시료의 총 페놀 함량은 Folin-Ciocalteu법(15)에 따라 함량을 측정하였다. 캡튜브에 시료를 0.5 mL 채취하고 1 N Folin-Ciocalteu 시약을 0.5 mL를 첨가하여 정확히 3분 후에 2% sodium carbonate anhydrous 포화용액 10 mL를 첨가한 후 1시간 동안 반응시킨 것을 여과하여 750 nm에서 UV-spectrophotometer(V-570, Jasco Co., Japan)로 흡광도를 측정하여 총 페놀 함량을 구하였다. 표준물질로는 tannic acid(Sigma Co.
대상 데이터
- 본 실험에 사용된 메밀은 강원도 봉평에서 2008년에 재배된 종자를 구입한 것을 사용하였다. 메밀 종자는 4시간 침수 시킨 뒤 건전한 것을 선별한 후 1일 4회 15분간 분주하도록 설정한 새싹재배기(Mikrofarm, EasyGreen Co.
- , Japan)로 흡광도를 측정하여 총 페놀 함량을 구하였다. 표준물질로는 tannic acid(Sigma Co., USA)를 사용하였다.
데이터처리
- 각각의 결과를 이용하여 최적 추출조건을 얻고자 반응표면 회귀분석을 실시하여 각종속변수 즉, 수율, 총페놀성 화합물 함량, α-glucosidase 저해활성 및 ACE 저해활성에 대한 회귀식을 얻었다(Table 4).
- 또한, 이들 요인 변수에 의한 영향을 받는 종속변수(Yn)는, 추출물의 품질인자로서 수율(Y1), 총페놀성 화합물 함량(Y2), ACE 저해활성(Y3) 및 α-glucosidase 저해 활성(Y4)으로 하였으며, 이들은 3회 반복 측정하여 그 평균값을 회귀분석에 사용하였다.
이론/모형
- α-glucosidase 저해활성은 nitrophenol 분석법(16)을 응용하여 측정하였다.
- Cushman과 Cheung의 방법(17)에 의하여 ACE 저해활성을 측정하였다. 즉, angiotensin-Ι 전환효소로 rabbit lung acetone powder(Sigma Co.
- 또한, 이들 요인 변수에 의한 영향을 받는 종속변수(Yn)는, 추출물의 품질인자로서 수율(Y1), 총페놀성 화합물 함량(Y2), ACE 저해활성(Y3) 및 α-glucosidase 저해 활성(Y4)으로 하였으며, 이들은 3회 반복 측정하여 그 평균값을 회귀분석에 사용하였다. 변수들의 추출특성과 그에 상응하는 최적 추출조건은 Mathematica program(14)을 이용하여 4차원 반응표면으로 나타내었다.
- 본 실험에서는 반응표면분석법(response surface methodology; RSM)을 이용하여 최적 추출조건의 예측과 추출조건에 따른 추출물의 이화학적 특성을 모니터링하였다. 추출조건의 최적화를 위한 실험계획은 중심합성계획법에 의하여 설계하였고, 반응표면분석을 위해서는 SAS(statistical analysis system) program(13)을 사용하였다.
- 시료의 총 페놀 함량은 Folin-Ciocalteu법(15)에 따라 함량을 측정하였다. 캡튜브에 시료를 0.
- 본 실험에서는 반응표면분석법(response surface methodology; RSM)을 이용하여 최적 추출조건의 예측과 추출조건에 따른 추출물의 이화학적 특성을 모니터링하였다. 추출조건의 최적화를 위한 실험계획은 중심합성계획법에 의하여 설계하였고, 반응표면분석을 위해서는 SAS(statistical analysis system) program(13)을 사용하였다.
성능/효과
- α-glucosidase 저해 활성능은 에탄올농도에 큰 영향을 받고 있었으며, 에탄올농도가 증가할수록 저해율이 증가하는 경향을 나타내었고, 추출시간에는 큰 영향을 받지 않는 것으로 나타났다.
- 44%로 예측되었다. ACE 저해 활성능은 에탄올농도에 많은 영향을 받고 있는 것으로 나타났으며, 추출시간에 의해서도 영향을 받는 것으로 나타났으나, 추출온도에 대해서는 상대적으로 미비한 것을 알 수 있었다. ACE 저해활성에 관한 메밀의 연구에서(27) 메밀의 ACE 저해활성이 39.
- 그 결과 메밀 새싹 추출물의 품질특성을 최대화 할 수 있는 추출조건으로 추출온도 0∼70℃, 추출시간 2∼8 hr 및 에탄올농도 30∼80%로 나타났으며(Fig 5), 이 범위내의 임의의 조건(추출온도 15℃, 추출시간 5 hr 및 에탄올농도 50%)에서 수율 15.18%, 총페놀성 화합물 함량 189.27 mg/100 g, α-glucosidase 저해효과 77.44% 및 ACE 저해효과 85.24%로 예측되었다(Table 7).
- 그래서 RSM 기법에 의해 예측된 값과 동일조건에서 실제 실험하여 얻은 실험치를 비교했을 때 수율, α-glucosidase 저해활성능 및 ACE 저해활성능은 예측 범위와 유사한 값을 나타내었고 총 페놀 함량은 조금 낮은 값을 나타내어 도출된 회귀식의 신뢰성을 검증할 수 있었다.
- 8875으로 유의성이 1%이내의 유의수준에서 인정되었다. 메밀새싹 추출물의 총페놀성 화합물 함량의 예측된 정상점은 최대점으로 최대값은 추출온도 28.11℃, 추출시간 8.65 hr 및 에탄올농도 81.73%로 예측되었다. 총페놀성 화합물 함량은 에탄올농도에 큰 영향을 받고 있었으며, 추출온도 및 추출시간에 대한 영향은 다소 작은 것으로 나타났다.
- 9461으로 유의성이 1%이내의 유의수준에서 인정되었다. 예측된 최대값은 추출온도 55.75℃, 추출시간 8.75 hr 및 에탄올농도 15.65%로 예측되었다. 이것은 반응표면분석으로 예측된 값을 나타낸 것으로 수율은 에탄올농도에 큰 영향을 받고 있었으며, 추출온도와 시간에 의해서도 영향을 받는 것으로 나타났다.
- 65%로 예측되었다. 이것은 반응표면분석으로 예측된 값을 나타낸 것으로 수율은 에탄올농도에 큰 영향을 받고 있었으며, 추출온도와 시간에 의해서도 영향을 받는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 추출온도가 높고 추출시간이 길어지면 팽창된 고형물의 용해속도 및 용해력이 증가하여 수율이 증가되는 것으로 볼 수 있으며, Kim 등(18)의 연구에서는 추출온도 및 추출시간이 증가할수록 수율이 증가하는 경향을 보였으며, Park 등(19)의 산국 에탄올 추출물의 가용성 고형분 함량이 에탄올 농도에 영향을 많이 받고 있다는 보고와 유사한 경향을 나타내었다.
- 중심합성계획에 따라 추출온도(0∼100 ℃), 추출시간(0∼12 hr) 및 에탄올 농도(0∼100%)를 달리하였을 때 반응 표면 회귀식의 R2는 수율, 총 페놀, α-glucosidase 저해활성능 및 ACE 저해활성능에서 각각 0.9461(p<0.001), 0.8875(p<0.005), 0.9186(p<0.005) 및 0.8667(p<0.005)로 나타내었으며, 추출 조건별 총 페놀 함량, α-glucosidase 저해활성능 및 ACE 저해활성능에 대한 반응표면을 superimposing하여 얻은 최적 추출조건 범위는 추출온도 0∼70℃, 추출시간 2∼8 hr 및 에탄올 농도 30∼80%로 나타내었다.
- 즉 ACE 저해활성은 18.74∼90.66%의 범위였으며, 결과에 대한 반응표면 회귀식의 R2는 0.8667으로 유의성이 1%이내의 유의수준에서 인정되었다.
- 73%로 예측되었다. 총페놀성 화합물 함량은 에탄올농도에 큰 영향을 받고 있었으며, 추출온도 및 추출시간에 대한 영향은 다소 작은 것으로 나타났다. 퉁퉁마디의 에탄올 추출조건 연구에서 보고한 총페놀성 화합물 함량이 추출온도에 비하여 에탄올 농도가 더 큰 영향을 주고 있다는 보고와 유사한 경향을 나타내었다(21).
- 최적 추출조건 범위내의 임의의 조건인 추출온도 15℃, 추출시간 5 hr 및 에탄올 농도 50 %를 회귀식에 대입하여 얻은 예측값은 수율 15.18%, 총 페놀 함량 189.27 mg/100 g, α-glucosidase 저해활성능 77.44 % 및 ACE 저해활성능 85.24%으로 예측되었으며, 실제 실험을 통해 얻어진 값은 수율 16.18%, 총 페놀 함량 175.57 mg/100 g, α-glucosidase 저해활성능 79.17% 및 ACE 저해활성능 81.60%으로 매우 유사하게 나타났다.
- 8667으로 유의성이 1%이내의 유의수준에서 인정되었다. 회귀식에 의한 메밀새싹 추출물의 ACE 저해 활성능의 예측된 정상점은 최대점으로 최대값은 86.91%로 예측되었으며, 이때의 추출조건은 추출온도 10.12℃, 추출시간 4.86 hr 및 에탄올농도 44.44%로 예측되었다. ACE 저해 활성능은 에탄올농도에 많은 영향을 받고 있는 것으로 나타났으며, 추출시간에 의해서도 영향을 받는 것으로 나타났으나, 추출온도에 대해서는 상대적으로 미비한 것을 알 수 있었다.
- 회귀식을 바탕으로 한 α-glucosidase 저해 활성능의 예측된 정상점은 안장점으로 능선분석을 실시하여 본 결과, 최대값은 85.38%로 예측되었으며, 이때의 추출조건은 추출온도 9.62℃, 추출시간 7.86 hr 및 에탄올농도 57.58%로 예측되었다.
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