[논문]식용유지와 영유아식품 중 아플라톡신 분석방법

허수정; 박승영; 김순선; 이준구; 송지영; 강은귀; 이현숙; 조대현

doi:10.5806/ast.2011.24.2.150

식용유지와 영유아식품 중 아플라톡신 분석방법
Analytical method of aflatoxins in edible oil and infant-children foods 원문보기

분석과학 = Analytical science & technology, v.24 no.2, 2011년, pp.150 - 157

허수정 (경인지방식품의약품안전청 유해물질분석과) , 박승영 (경인지방식품의약품안전청 유해물질분석과) , 김순선 (경인지방식품의약품안전청 유해물질분석과) , 이준구 (경인지방식품의약품안전청 유해물질분석과) , 송지영 (경인지방식품의약품안전청 유해물질분석과) , 강은귀 (경인지방식품의약품안전청 유해물질분석과) , 이현숙 (경인지방식품의약품안전청 유해물질분석과) , 조대현 (경인지방식품의약품안전청 유해물질분석과)

초록
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아플라톡신은 Aspergillus flavus와 A. parasiticus에 의해 생성되는 독소대사산물로 발암물질이며 곡류(옥수수, 쌀, 보리), 땅콩, 과실류 및 종자류의 생산과 저장과정에서 생성된다. 곰팡이가 생성되기 쉬운 조건에서 오랜 기간 저장된 종자류에서 아플라톡신이 생성될 가능성이 있으며 이를 원료로 하여 유지로 가공 할 때도 아플라톡신이 이행될 우려가 있다. 또한 곡류나 두류 등을 가공하여 만든 영유아용식품도 아플라톡신 오염 가능성이 있다. 따라서 본 연구는 식용유지 및 영유아용식품에 대해 액체 추출법의 아플라톡신 시험법 적용가능 여부를 검토하고 필요시 새로운 분석방법을 확립하고자 하였다. 식용유지에 대한 아플라톡신은 MSPD (Matrix Solid Phase Dispersion)법으로 아플라톡신을 추출해 내고 면역친화성 칼럼을 사용해 정제하여 형광검출기가 장착된 고성능액체크로마토그래피(HPLC/FLD)를 이용해 분석하였다. 아플라톡신($B_1$, $B_2$, $G_1$, $G_2$) 검량선의 직선성은 상관계수가 0.999 이상을 나타냈고 회수율은 85.9~93.0%의 양호한 결과를 얻었으며 상대표준편차는 5.7% 이하였다. 식용유지에서 액체 추출법과 비교해 볼 때, MSPD-면역친화성컬럼법을 사용하여 회수율을 향상시켜 시험법을 확립하였다. 영유아용식품에 대한 아플라톡신 분석방법은 액체 추출법이 적합하였으며 아플라톡신($B_1$, $B_2$, $G_1$, $G_2$)에 대한 회수율은 89.5~92.3%로 양호한 결과를 얻었다.

Abstract ▼ AI-Helper

Aflatoxins are secondary metabolites of the molds of Aspergillus flavus and Aspergillus parasiticus. They are highly carcinogenic compounds and can affect a wide range of vegetable commodities such as cereals (especially corn), nuts, peanuts, fruits and oil seeds, in the field and during storage. In fact, oilseeds are often stored for weeks in conditions that promote the mould growth, and the possible consequent presence of aflatoxins in oilseeds can lead to their transfer in oil. In addition, aflatoxins can be found as a natural contaminant in multi-cereals and beans making baby food for infants and young-children. The objective of this study was to validate the liquid extraction method or develop an analytical method for edible oil and infant-children foods. Therefore, this study developed condition of extract for aflatoxins ($B_1$, $B_2$, $G_1$ and $G_2$) in edible oil using a high performance liquid chromatography with florescence detector (HPLC/FLD). Aflatoxins were extracted from edible oil samples by means of MSPD (Matrix solid phased dispersion), utilizing $C_{18}$ as dispersing material and purified by using immunoaffinity column. The gression line coefficients were above 0.999. The recoveries for aflatoxins ranged from 85.9 to 93.0%, and relative standard deviations were below 5.7%. The new developed method of aflatoxins effectively enhanced recoveries by using MSPD-Immunoaffinity column compared with liquid extraction. The analytical method for liquid extraction of aflatoxin was appropriate for infant-children food. Reviewing the current method, the recoveries of aflatoxins ($B_1$, $B_2$, $G_1$ and $G_2$) were 89.5~92.3%.

주제어

AI 본문요약
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문제 정의

¹⁵ 현재 식품공전에는 곡류, 두류, 땅콩, 견과류 및 그 가공품, 된장, 고추장, 고춧가루 등에 대하여 TLC 에 의한 시험법과 추출 후 TFA로 유도체화 시켜 HPLC/FLD를 이용한 시험법이 수록되어 있다.¹⁶ 일반적으로 시료의 성상에 따라 전처리 방법이 다르게 적용 될 수 있으므로 본 연구에서는 식용유지 및 영유 아용식품에 대하여 액체 추출법이 적용 가능한 지를 검토하고 개선함으로써 이들 식품에 대한 분석방법을 확립하고자 한다.

제안 방법

따라서 본 연구에서도 아플라톡신 B1 이 약 0.02, 0.05, 0.1 및 0.2 µg/kg이 되도록 첨가한 영유아용식품을 액체 추출법으로 전처리 한 후 HPLC/FLD의 주입량을 50, 100 µL로 비교 분석하였으며, 식품공전의 액체 추출법에 제시되어있는 10 µL에서도 분석하여 비교하였다.
식용유지 중 아플라톡신 분석 시 아플라톡신 혼합용액을 아세토니트릴로 1, 2, 5, 10, 25 µg/kg (아플라톡신 B1 기준, B1:B2:G1:G2 = 1:0.28:0.94:0.28)의 농도가 되도록 희석하고, 영유아용식품 중 아플라톡신 분석시 0.05, 0.1, 0.15, 0.2, 0.25 µg/kg (아플라톡신 B1 기준, B1:B2:G1:G2 = 1:0.28:0.94:0.28)의 농도로 희석하여 검량선 작성을 위한 표준용액으로 하였다.
아플라톡신 혼합표준용액을 5단계로 희석하여 직선성을 확인하였다. 실험은 3회 반복하였으며 각각의 농도 범위(Table 2)안에서 상관계수는 0.
용매로서 메탄올(HPLC grade, Burdick & Jackson, Seoul, Korea), 아세토니트릴(acetonitrile, HPLC grade, Burdic&Jackson)을 사용하였고, 시료 전처리와 이동상에 사용되는 물은 초순수를 사용하였다. 아플라톡신용 면역친화성칼럼(Immuno affinity column)은 Afla Test TM WB(VICAM)를 사용하였다.
아플라톡신을 정량분석하기 위해 형광검출기가 장착된 HPLC/FLD (Shiseido, Japan)를 사용하였다. 아플라톡신 분석에 사용된 이동상 및 기기조건은 Table 1 과 같다.
7% 이하였다. 액체 추출법과 비교해 볼 때, MSPD법-면역친화성 컬럼을 사용하여 회수율을 향상시켜 시험법을 확립하였다. 또한, 영유아용식품에 대한 아플라톡신 분석방법은 액체 추출법이 적합하였다.
액체 추출법의 식용유지 분석 적합성과 본 연구 시험법의 적합성을 비교해 보기 위해 식용유지에 아플라톡신 B1을 기준으로 10 µg/kg 이 되도록 혼합표준 용액(아플라톡신 B1:B2:G1:G2농도비=1:0.28:0.94:0328) 을 첨가하여 회수율을 비교해 보았다.
용출액을 50℃에서 감압 건고시키고 잔류물에 트리플루오로초산 0.2 mL를 가하여 어두운 곳에서 15분간 방치시킨 후 아세토니트릴·물(20:80, v/v) 혼합용액 0.8 mL를 가하여 혼합하고 0.45 µm 멤브레인필터로 여과하여 HPLC/FLD로 분석하였다.
용출액을 50℃에서 질소로 건고시키고 잔류물에 트리플루오로초산 0.2 mL를 가하여 어두운 곳에서 15분간 방치시킨 후 아세토니트릴·물(20:80, v/v) 혼합용액 0.8 mL를 가하여 혼합하고 0.45 µm 멤브레인필터로 여과하여 HPLC/FLD로 분석하였다.
콩기름에서 MSPD법을 사용하여 메탄올로 추출하는 방법¹⁷을 시도하였을 때 매트릭스의 영향 없이 아플라톡신(G₁ , B₁ , G₂ , B₂ )의 특이성이 입증되었다, 반면, 참기름에서는 Fig. 3에서 보는 바와 같이 매트릭스의 영향으로 분석이 불가하였으나 아플라톡신에 선택성을 갖는 면역친화성 컬럼을 이용한 정제로 매트릭스 영향을 해결하였으며 그 이후의 TFA 유도체화 과정은 액체 추출법과 동일하게 실험하였다.

대상 데이터

본 연구의 대상식품인 영아용 조제식, 성장기용 조제식, 영·유아용 곡류조제식 및 기타 영·유아식은 곡류 및 두류 등을 주성분으로 하여 가공한 것이고, AOAC의 영유아용 식품 중 아플라톡신 분석의 전처리방법18 을 보면 액체 추출법의 전처리 방법과 비슷하였다.
분석에 사용한 표준품은 아플라톡신혼합액(Aflatoxin Mix varied in benzene: acetonitrile (98:2), Supelco)으로 아플라톡신 B₁ , B₂ , G₁ , G₂ 가 포함된 것을 사용하였으며, 트리플루오로초산(trifluoroactic acid)은 Sigma에서 구입하여 사용하였다. 용매로서 메탄올(HPLC grade, Burdick & Jackson, Seoul, Korea), 아세토니트릴(acetonitrile, HPLC grade, Burdic&Jackson)을 사용하였고, 시료 전처리와 이동상에 사용되는 물은 초순수를 사용하였다.
용매로서 메탄올(HPLC grade, Burdick & Jackson, Seoul, Korea), 아세토니트릴(acetonitrile, HPLC grade, Burdic&Jackson)을 사용하였고, 시료 전처리와 이동상에 사용되는 물은 초순수를 사용하였다.

데이터처리

총 35개 기관이 참여하였으며 분석결과는 정규분포에 따라 통계처리 되어 Z-score값이 -2 ~ +2의 범위에 들어가면 ‘stisfactory’로 판정된다.

이론/모형

본 연구에서 확립한 아플라톡신 시험법 중 영유아용 식품에 대한 분석방법을 검증하기 위해 영국 DEFRA (Department for Environment Food and Rural Affairs)산하 기관인 FERA (Food & Environment Assessment Research)에서 주관하는 FAPAS (Food Analysis Performance Assessment Scheme) 검사능력관리프로그램의 Aflatoxin B&G&/total in baby food 분석에 참여하였다.
식용유지 중 아플라톡신 분석은 MSPD (matrix solid phase dispersion)법으로 아플라톡신을 추출해 내고 면역친화성 칼럼을 사용해 정제하여 형광검출기가 장착된 고성능액체크로마토그래피(HPLC/FLD)를 이용해 분석하였다. 아플라톡신(B₁ , B₂ , G₁ , G₂ ) 검량선의 직선성은 상관계수 0.

성능/효과

⁵이들은 무색에서 연노랑색의 결정체로 자외선 하에서 나타내는 형광의 색에 따라 B (blue)군, G (green)군으로 구분되며 동물의 소변과 우유에서 발견되는 M (metabolized)군은 대사물질로 청자색(blue-violet)형광을 나타낸다.⁶ 아플라톡신의 독성은 모두 다르며 이 중 아플라톡신 B₁ 이급성독성 및 만성독성 시험에서 가장 강력한 독성을 나타내고 그 다음은 아플라톡신 G₁ , B₂ , G₂ 순이다. 또한 물, 핵산, 에테르와 같은 비극성 용매에는 거의 녹지 않지만 클로르포름, 메탄올과 같은 중간정도의 극성유기 용매에 잘 녹는 것으로 알려져 있다.
94:0328) 을 첨가하여 회수율을 비교해 보았다. 그 결과 액체 추출법으로 분석하였을 때 아플라톡신 G₁ , B₁ 은 각각 80.3, 90.6%로 양호한 회수율을 보였으나 G₂ , B₂ 는 각각 44.0%, 49.6%로 나타났다. 반면 MSPD-면역친화성 컬럽법을 이용한 식용유지 중 아플라톡신 시험법의 회수율은 G₁ , B₁ , G₂ 및 B₂ 는 각각 97.
본 연구의 대상식품인 영아용 조제식, 성장기용 조제식, 영·유아용 곡류조제식 및 기타 영·유아식은 곡류 및 두류 등을 주성분으로 하여 가공한 것이고, AOAC의 영유아용 식품 중 아플라톡신 분석의 전처리방법¹⁸ 을 보면 액체 추출법의 전처리 방법과 비슷하였다. 따라서 영유아용식품 중 아플라톡신 분석은 액체 추출법으로 적용 가능할 것으로 판단되었다. 다만, 영유아용식품에서 아플라톡신을 분석한 기존의 연구들^19-20을 보면 기기분석조건 에서 주입량을 100~1000 µL로 늘려 0.
6% 보다 향상되었다(Table 5). 또한 다양한 식용유 지에서 회수율에 차이가 없는지를 확인하기 위하여 참기름, 들기름, 콩기름, 향미유 및 옥수수유를 대상으로 실험한 결과 모든 아플라톡신이 78.1~100.0%의 양호한 회수율을 보였다(Table 6).
액체 추출법과 비교해 볼 때, MSPD법-면역친화성 컬럼을 사용하여 회수율을 향상시켜 시험법을 확립하였다. 또한, 영유아용식품에 대한 아플라톡신 분석방법은 액체 추출법이 적합하였다. 아플라톡신(B₁ , B₂ , G₁ , G₂ )에 대한 회수율은 89.
또한, 참기름시료에 혼합표준용액(아플라톡신 B1 :B2 :G1 :G2 =1:0.28:0.94:0.28)을 아플라톡신 B1을 기준으로 10 µg/kg으로 첨가하여 전처리과정에 따라 6회 반복 실험한 결과, 상대표준편차(CV, %)는 2.5~8.1%로 만족할 만한 수준이었다.
6%로 나타났다. 반면 MSPD-면역친화성 컬럽법을 이용한 식용유지 중 아플라톡신 시험법의 회수율은 G₁ , B₁ , G₂ 및 B₂ 는 각각 97.2, 84.8, 89.9 및 100.0%로 액체 추출법에 의한 회수율 80.3 90.6 44.0 49.6% 보다 향상되었다(Table 5). 또한 다양한 식용유 지에서 회수율에 차이가 없는지를 확인하기 위하여 참기름, 들기름, 콩기름, 향미유 및 옥수수유를 대상으로 실험한 결과 모든 아플라톡신이 78.
본 연구에서 확립한 방법으로 분석한 결과, Aflatoxin B&G&/total in baby food 전 항목에서 ‘satisfactory’를 받았으며 양호한 Z-score값(Fig. 4~8)으로 영유아용식품 중 아플라톡신 분석능력을 인증받았다.
아플라톡신 혼합표준용액을 5단계로 희석하여 직선성을 확인하였다. 실험은 3회 반복하였으며 각각의 농도 범위(Table 2)안에서 상관계수는 0.9992~0.9999로 양호한 직선성을 보였다. 크로마토그램에서 얻어진 peak의 신호대 잡음비(S/N, signal to noise ratio)를 3과 10으로 하였을 때 검출한계와 정량한계는 Table 3 과 같았다.
아플라톡신 혼합표준용액을 5단계로 희석하여 직선성을 확인하였다. 실험은 3회 반복하였으며 각각의 농도 범위(Table 7)안에서 상관계수는 0.996~0.997으로 양호한 직선성을 보였다. 신호대 잡음비(S/N, signal to noise ratio)를 3과 10으로 하였을 때 검출한계와 정량한계는 Table 8과 같았다.
아플라톡신 분석법에 대한 회수율을 측정하기 위해 영유아용 식품에 아플라톡신 B1 을 기준으로 0.1, 0.2 µg/kg이 되도록 혼합표준용액(아플라톡신 B1 :B2 :G1 :G2 농도비=1:0.28:0.94:0.28)을 첨가하여 회수율을 3회 반복하여 실험한 결과 아플라톡신 B1, B2, G1, G2의 회수율이 각각 82.9~91.2%, 86.1~90.7%, 85.4~92.3% 및 85.9~89.5%로 나타났다(Table 9).
식용유지 중 아플라톡신 분석은 MSPD (matrix solid phase dispersion)법으로 아플라톡신을 추출해 내고 면역친화성 칼럼을 사용해 정제하여 형광검출기가 장착된 고성능액체크로마토그래피(HPLC/FLD)를 이용해 분석하였다. 아플라톡신(B₁ , B₂ , G₁ , G₂ ) 검량선의 직선성은 상관계수 0.999 이상을 나타냈고 회수율은 85.9~93.0%의 양호한 결과를 얻었으며 상대표준편차는 5.7% 이하였다. 액체 추출법과 비교해 볼 때, MSPD법-면역친화성 컬럼을 사용하여 회수율을 향상시켜 시험법을 확립하였다.
또한, 영유아용식품에 대한 아플라톡신 분석방법은 액체 추출법이 적합하였다. 아플라톡신(B₁ , B₂ , G₁ , G₂ )에 대한 회수율은 89.5~92.3% 로 양호한 결과를 얻었으며, 아플라톡신(B1, B2, G1, G2)에 대한 정량한계는 0.019, 0.015, 0.053, 0.012 µg/ kg 이었다.
영유아용식품에 혼합 표준용액(아플라톡신 B1 :B2 :G1 :G2 =1:0.28:0.94:0.28)을 아플라톡신 B1 을 기준, 0.1 µg/kg으로 첨가하여 전처리과정에 따라 6회 반복 실험한 결과, 상대표준편차 (CV, %)는 2.9~7.8로 만족할 만한 수준이었다.
회수율 측정을 위해 참기름시료에 아플라톡신 B1 을 기준으로 5, 10 20 µg/kg이 되도록 혼합표준용액(아플라톡신 B1 :B2 :G1 :G2 농도비=1:0.28:0.94:0.28)을 첨가하여 회수율을 3 회 반복 실험한 결과 아플라톡신 B1, B2, G1, G2의 회수율이 각각 85.3~95.2, 93.0~104.9, 82.2~95.2 및 80.9~91.7%로 나타났다(Table 4).

질의응답

핵심어	질문	논문에서 추출한 답변
	아플라톡신류는 어떤 환경에서 잘 생성되는 것으로 알려져 있나요?	parasiticus 등의 진균류에 의해 생성되며, 인간과 가축에게 가장 치명적인 독성을 나타내는 독소로 간에 직접적인 영향을 미쳐 간암을 일으키는 등 국제암연구소(International Agency for Research on Cancer, IARC)에서 인체발암 물질 Group 1으로 분류하고 있다. 주로 땅콩 등의 견과류 및 쌀, 보리, 밀, 옥수수 등과 같은 곡류에서 온도 28~30, 상대습도 80~85% 조건의 고온다습한 열대나 아열대지방에서 잘 생성되며 수확에서 건조까지 저장기간이 길고 환기가 불충분할수록 잘 생성되는 것으로 알려져 있다. 1-3 아플라톡신에 관한 연구는 1960년 영국에서 곰팡이(Aspergillus flavus)로 오염된 브라질산 땅콩사료를 먹인 칠면조 10만 마리가 집단 폐사한 사건으로 시작되었다.
	아플라톡신류은 무엇에 의해 생성되나요?	아플라톡신류(Aflatoxins)은 식품 및 농산물과 관련 하여 Aspergillus. flavus 및 Aspergillus. parasiticus 등의 진균류에 의해 생성되며, 인간과 가축에게 가장 치명적인 독성을 나타내는 독소로 간에 직접적인 영향을 미쳐 간암을 일으키는 등 국제암연구소(International Agency for Research on Cancer, IARC)에서 인체발암 물질 Group 1으로 분류하고 있다. 주로 땅콩 등의 견과류 및 쌀, 보리, 밀, 옥수수 등과 같은 곡류에서 온도 28~30, 상대습도 80~85% 조건의 고온다습한 열대나 아열대지방에서 잘 생성되며 수확에서 건조까지 저장기간이 길고 환기가 불충분할수록 잘 생성되는 것으로 알려져 있다.
	아플라톡신류는 인간과 가축에게 무엇이며, 국제암 연구소에서는 무엇으로 분류하고 있나요?	flavus 및 Aspergillus. parasiticus 등의 진균류에 의해 생성되며, 인간과 가축에게 가장 치명적인 독성을 나타내는 독소로 간에 직접적인 영향을 미쳐 간암을 일으키는 등 국제암연구소(International Agency for Research on Cancer, IARC)에서 인체발암 물질 Group 1으로 분류하고 있다. 주로 땅콩 등의 견과류 및 쌀, 보리, 밀, 옥수수 등과 같은 곡류에서 온도 28~30, 상대습도 80~85% 조건의 고온다습한 열대나 아열대지방에서 잘 생성되며 수확에서 건조까지 저장기간이 길고 환기가 불충분할수록 잘 생성되는 것으로 알려져 있다.

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표제어: PCR

동의어: Packet Collision Rate

용어 설명 출처 목록 (6)

용어 설명: PCR은 세균 특이성이 있는 primer를 이용하여 적은 수의 세균이 있을지라도 쉽게 검출할 수 있는 유용한 방법이며, 이를 이용하여 구강 내 치면세균막이나 타액에서 직접 세균을 검출할 수 있게 되었다[8].

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