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문제 정의
- 최적화 기법 중, 기본 추출조건에 하나의 독립변수를 변화시키는 단일변수 최적화법은 복수의 독립변수가 종속변수에 미치는 상관관계와 통계학적 유의성 및 실험범위 외의 결과 예측에 어려운 한계점을 지닌다. 본 실험에서는 통계학적 최적화 기법의 일종인 반응표면 분석법을 도입하여 독립변수 상호영향을 고려하여 최적조건을 예측하고자 통계학적 최적화를 수행하였다[9]. 아래 식 (2)에 보여지는 바와 같이 반응표면 분석법 중 하나인 중심합성계획법 이용하여 2차 회귀방정식을 아래와 같이 구하였다.
- 이에 종실 수확 후 버려지는 아마란스 잎을 이용하여 생리활성물질 생산을 통한 고부가가치 수요를 창출할 필요가 있다. 본 연구의 목적은 아마란스 종실 부산물인 잎으로부터 고부가가치 항산화 물질인 폴리페놀 생산을 위한 상업화에 적합한 추출공정을 제안함에 있다. 이를 위해 열수추출 공정에서 추출온도, 추출시간 및 알코올농도를 통계학적 기법을 통해 최적화하여 아마란스 부산물로부터 생리활성을 가진 고부가가치 소재 생산을 하고자 한다.
제안 방법
- Folin-Ciocalteu's 페놀용액을 희석 추출물에 첨가하여 폴리페놀 화합물에 의해 청색으로 환원 발색하는 원리에 근거하여 흡광도 변화로 폴리페놀 농도를 측정하였다.
- 건조 된 아마란스 잎의 열수추출공정의 조건을 탐색하기 위하여 반응표면분석법(response surface methodology, RSM)을 사용하였다. 기존 본 실험실에서 수행한 단일변수 최적화에 기반하여 추출공정에서 중요한 변수인 추출온도(X1), 추출시간(X2)과 에탄올 농도(X3)를 독립변수(independent variables)로 하여 Table 1에서와 같이 각각 5단계의 수준에서 중심합성계획(central composite design, CCD)에 따라 실험을 진행하였다. 독립변수인 폴리페놀 추출에 미치는 영향을 평가하기 위해 Table 2에 나타낸 바와 같이 CCD 설계에 따라 3개의 독립변수를 변화시켜 17회 독립실험을 통해 2차 회귀방정식을 식 (1)과 같이 도출하여 공정변수간의 상호작용, 경향성, 신뢰성 및 예측 등을 SuperPro Designer 9.
- 05 mm이상 입자와 이물질을 제거한 후 사용하였다. 시료 중의 유용성분 추출을 위해 밀폐형 유리튜브에 건조 시료 1 g과 용매 20 ml을 첨가하여 추출 조건에 따라 온도와 시간을 변화시켜(KMC-1205SW1, Vision, Daejeon, Korea)에서 추출을 진행하였다. 추출 후, 1 ml의 추출시료를 원심분리 후 상등액을 회수하여 사용하였다.
- 열수추출의 최적조건을 도출하기 위해 SuperPro Designer 9.0을 사용하여 필요한 제한조건을 부여하여 최적조건을 탐색했다. 먼저, 폴리페놀 최대 생산 조건을 예측하기 위해 종속변수인 폴리페놀의 목적값을 최대로 설정하고 독립변수에 제한사항을 두지 않고 최적조건을 예측하였을 때, 90.
- 본 연구의 목적은 아마란스 종실 부산물인 잎으로부터 고부가가치 항산화 물질인 폴리페놀 생산을 위한 상업화에 적합한 추출공정을 제안함에 있다. 이를 위해 열수추출 공정에서 추출온도, 추출시간 및 알코올농도를 통계학적 기법을 통해 최적화하여 아마란스 부산물로부터 생리활성을 가진 고부가가치 소재 생산을 하고자 한다.
- 보다 경제적인 추출공정 운전을 위해서는 폴리페놀 생산량은 최대로 유지하면서 에너지와 재료투입 최소화가 필요하다. 이를 위해 폴리페놀 농도는 목적값을 최대로 설정하고 추출온도, 추출시간과 에탄올 농도를 최소로 제한조건을 설정하여 최적조건을 탐색하였다. 공정시간 단축과 낮은 에탄올 농도는 생산성 향상과 원료비 절감효과가 있으며 낮은 추출온도는 운전비용과 설비비의 절감효과를 예상할 수 있다.
- 05) 추출온도와 시간이 증가할수록 비례하여 증가함을 알 수 있었다. 폴리페놀 생산을 최대화 하기 위해 90.1 ℃, 61.6 (v/v%)와 50분 추출조건이 필요하나 에너지와 원료투입을 고려한 추출에서는 70.5 ℃, 50 (v/v%), 17.9 min 추출이 경제적인 대안으로 제안되었다. 경제적 측면을 고려한 추출방법이 에너지비용과 설비비를 낮추고 생산성을 높이는 조건이긴 하나 폴리페놀 농도가 12.
- 폴리페놀 추출에 있어 열수추출의 온도와 시간의 상관관계를 평가하기 위해 추출온도를 95 ℃로 고정하고 온도와 시간에 영향을 3차원 그래프상에서 예측하였다. Fig.
대상 데이터
-
2-2. 추출 조건
건조 아마란스 잎은 식품분쇄기(HMF-3000S, Hanil, Korea)를 사용하여 분쇄하여 0.05 mm이상 입자와 이물질을 제거한 후 사용하였다. 시료 중의 유용성분 추출을 위해 밀폐형 유리튜브에 건조 시료 1 g과 용매 20 ml을 첨가하여 추출 조건에 따라 온도와 시간을 변화시켜(KMC-1205SW1, Vision, Daejeon, Korea)에서 추출을 진행하였다.
- 본 연구에 사용 된 아마란스 잎은 충남 성거읍 성거산약초(주)에서 2015년 7월에 수확한 종실이 제거 된 상태로 공급받아 60 ℃ 오븐(OF-22GW, Jeiotech, Daejeon, Korea)에서 12시간 건조 후 5 ℃ 냉동보관하여 사용하였다. 추출용매로 사용한 유기용매는 Sigma-Aldrich 사(St.
- 추출 후, 1 ml의 추출시료를 원심분리 후 상등액을 회수하여 사용하였다. 실험에 사용 된 추출조건은 Table 1과 같으며 희석한 시료는 필요에 따라 희석하여 폴리페놀 측정에 사용하였다.
- 본 연구에 사용 된 아마란스 잎은 충남 성거읍 성거산약초(주)에서 2015년 7월에 수확한 종실이 제거 된 상태로 공급받아 60 ℃ 오븐(OF-22GW, Jeiotech, Daejeon, Korea)에서 12시간 건조 후 5 ℃ 냉동보관하여 사용하였다. 추출용매로 사용한 유기용매는 Sigma-Aldrich 사(St. Louis, USA)와 Samchun Pure Chemical 사(Seoul, Korea) 의 순도 95 (v/v%) 이상 시약을 사용하였으며 분석에 사용된 시약은 Sigma-Aldrich사의 일급 이상 시약을 사용하였다.
데이터처리
- 기존 본 실험실에서 수행한 단일변수 최적화에 기반하여 추출공정에서 중요한 변수인 추출온도(X1), 추출시간(X2)과 에탄올 농도(X3)를 독립변수(independent variables)로 하여 Table 1에서와 같이 각각 5단계의 수준에서 중심합성계획(central composite design, CCD)에 따라 실험을 진행하였다. 독립변수인 폴리페놀 추출에 미치는 영향을 평가하기 위해 Table 2에 나타낸 바와 같이 CCD 설계에 따라 3개의 독립변수를 변화시켜 17회 독립실험을 통해 2차 회귀방정식을 식 (1)과 같이 도출하여 공정변수간의 상호작용, 경향성, 신뢰성 및 예측 등을 SuperPro Designer 9.0(Intelligen, Inc., US) 프로그램을 이용하여 분석하였다. 반응표면분석은 독립변수 Xi와 Xj에대한 종속변수 Y(폴리페놀 함량)는 다음과 같이 표현된다.
- 종속변수와 독립변수간의 관계를 Design-Expert를 이용하여 다중회 기분석 및 분산분석을 수행하여 유의성이 인정되는 변수만을 채택하여 각 종속변수 별 모델을 설정하고 이를 이용하여 반응표면분석법에 의해 최적조건을 탐색하였다.
이론/모형
- 건조 된 아마란스 잎의 열수추출공정의 조건을 탐색하기 위하여 반응표면분석법(response surface methodology, RSM)을 사용하였다. 기존 본 실험실에서 수행한 단일변수 최적화에 기반하여 추출공정에서 중요한 변수인 추출온도(X1), 추출시간(X2)과 에탄올 농도(X3)를 독립변수(independent variables)로 하여 Table 1에서와 같이 각각 5단계의 수준에서 중심합성계획(central composite design, CCD)에 따라 실험을 진행하였다.
- 폴리페놀 함량은 Milutinović 등의 방법에 따라 수행하였다[8]. Folin-Ciocalteu's 페놀용액을 희석 추출물에 첨가하여 폴리페놀 화합물에 의해 청색으로 환원 발색하는 원리에 근거하여 흡광도 변화로 폴리페놀 농도를 측정하였다.
성능/효과
- 7 mg GAE/g DM를 얻을 수 있었다. Fig. 3과4에서 본 바와 같이, 에탄올 농도 60% 부근에서 최대 폴리페놀 추출성능을 보이는데, 이는 차잎에서 폴리페놀 추출시, 시간의 영향은 크지 않으며 에탄올 40~50%에서 최대 폴리페놀을 추출할 수 있다는 Peiro [14]등의 보고와 경향성은 일치하지만 에탄올 농도의 불일치를 보이는 결과이다. 또한 Lee [15]등의 연구결과에서도 산수유열매 최적추출 에탄올 농도가 3~33% 임을 보고한 바가 있어 원료물질 별 최적농도가 다름을 예상할 수 있으며 원료물질에 적합한 용매농도 선택이 중요함을 알 수 있다.
- 05). 각 독립변수의 영향을 평가했을 때, Fig. 1에서 보는 바와 같이 추출온도와 추출시간이 증가할수록, 에탄올 농도가 감소할수록 폴리페놀의 추출이 증가하는 경향을 보임으로 최대 폴리페놀 추출은 낮은 에탄올 농도와 높은 수준의 추출온도와 추출 시간에서 형성될 것으로 예측할 수 있다.
- 에탄올의 농도가 증가함에 따라 폴리페놀 농도가 증가하다 60% 부근에서 다시 감소하는 형태로 변화를 보여 주며 50~60 ℃ 사이에서 최대값이 나타남을 확인할 수 있다. 낮은 에탄올 농도에서 추출온도에 따라 폴리페놀의 증가량이 미미한 것을 확인할 수 있었지만 에탄올 농도가 높은 조건에서는 온도의 영향이 상대적으로 크게 나타나는 것으로 나타났다. 최고 폴리페놀 농도 12.
- 0을 사용하여 필요한 제한조건을 부여하여 최적조건을 탐색했다. 먼저, 폴리페놀 최대 생산 조건을 예측하기 위해 종속변수인 폴리페놀의 목적값을 최대로 설정하고 독립변수에 제한사항을 두지 않고 최적조건을 예측하였을 때, 90.1 ℃, 61.6 (v/v%)와 50분 추출조건이 최적조건으로 확인되었으며 예측 된 폴리페놀 함량은 12.6 mg GAE/g DM 이었다. 보다 경제적인 추출공정 운전을 위해서는 폴리페놀 생산량은 최대로 유지하면서 에너지와 재료투입 최소화가 필요하다.
- 4에서 보는 바와 같이 추출시간에 따라 폴리페놀 농도가 증가하는 것을 확인할 수 있으나 영향은 매우 미미한 것으로 보인다. 반면 에탄올 농도가 변화에 따른 폴리페놀 농도의 민감도는 크며 50~60% 사이에서 최대값을 가짐을 재확인 할 수 있었다. 본 실험에서 76.
- 반면 에탄올 농도가 변화에 따른 폴리페놀 농도의 민감도는 크며 50~60% 사이에서 최대값을 가짐을 재확인 할 수 있었다. 본 실험에서 76.3 min, 63.3 (v/v%)와 90 ℃ 열수 추출 조건에서 최대 폴리페놀 농도인 12.7 mg GAE/g DM를 얻을 수 있었다. Fig.
- 아마란스 잎을 이용한 폴리페놀 열수추출공정 최적화 연구는 보고 된 바가 없으며 아마란스로부터 폴리페놀과 같은 유용산물을 생산함에 있어 추출조건 최적화를 통한 수율을 향상을 도모함으로써 보다 경제적이고 경쟁력 있는 추출공정을 제안했다는데 연구의 의의가 있다. 본 연구를 통해 아마란스 잎 유래 폴리페놀 추출을 최대화 할 수 있는 열수추출 조건을 확립하여 최대 12.6 mg GAE/g DM 폴리페놀 추출이 예측되었다. 아마란스 잎 유래의 폴리페놀 추출에 대한 연구결과는 많지는 않으나 Lopez-Mejia [7]등이 soxhlet에서 유기용매를 이용하여 추출한 결과인 6.
- 공정시간 단축과 낮은 에탄올 농도는 생산성 향상과 원료비 절감효과가 있으며 낮은 추출온도는 운전비용과 설비비의 절감효과를 예상할 수 있다. 세 가지 공정변수의 수준을 최소로 하여 최적화를 수행했을 때 70.5 ℃, 17.9 min, 50% (v/v%) 에탄올 조건에서 최대 폴리페놀 농도 11.5 mg GAE/g DM가 예측되었다.
- 3은 열수추출을 이용한 폴리페놀 추출에 있어 추출시간이 40분으로 고정되었을 때, 추출온도와 에탄올 농도가 폴리페놀 추출에 미치는 영향을 보여준다. 에탄올의 농도가 증가함에 따라 폴리페놀 농도가 증가하다 60% 부근에서 다시 감소하는 형태로 변화를 보여 주며 50~60 ℃ 사이에서 최대값이 나타남을 확인할 수 있다. 낮은 에탄올 농도에서 추출온도에 따라 폴리페놀의 증가량이 미미한 것을 확인할 수 있었지만 에탄올 농도가 높은 조건에서는 온도의 영향이 상대적으로 크게 나타나는 것으로 나타났다.
- 열수에 의해 추출되는 폴리페놀의 양은 추출 온도와 에탄올농도에 유의한 영향을 받으며(p<0.05) 추출온도와 시간이 증가할수록 비례하여 증가함을 알 수 있었다.
- 일차항에서 추출온도(X1)와 에탄올 농도는 (X3)가 유의한 영향을 미치는 것으로 나타났다(p<0.05).
- 2은 아마란스 잎의 열수추출을 이용한 폴리페놀 추출 시 추출온도와 추출시간이 폴리페놀 추출에 미치는 영향을 보여준다. 폴리페놀 추출은 온도가 높아질수록 크게 증가함을 보이나 시간에 따른 증가량은 크지 않은 것을 확인 할 수 있었다. 온도증가에 따른 폴리페놀 농도 증가는 분명하지만 증가속도는 50~60 ℃ 이후로 서서히 감소하는 경향 보이고 있다.
- 표에서 보는 바와 같이, 실험값과 예측값은 매우 잘 일치하며 회귀분석 결과 전체 회귀모델의 유의성이 인정되었고(p<0.05) 일차와 이차항 모두 유의함을 알 수 있었다(Table 2).
후속연구
- 9 min 추출이 경제적인 대안으로 제안되었다. 경제적 측면을 고려한 추출방법이 에너지비용과 설비비를 낮추고 생산성을 높이는 조건이긴 하나 폴리페놀 농도가 12.6에서 11.5 mg GAE/g DM로 낮아지는 trade-off가 있어 향후 두 조건에 의한 열수추출의 경제성 비교를 보다 면밀히 수행할 필요성이 있다.
- 본 실험에서 50 ℃ 이상에서 폴리페놀 농도가 감소하는 것은 추출 진행에 따른 고-액간의 농도차 감소로 추출의 driving force가 약해져 추출속도가 낮아진 것이 이유일 수 있다. 향후, 아마란스 폴리페놀의 열 안정성 실험을 통해 판단할 필요가 있다. 열수 추출공정의 최적화 조건인 71.
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